Про затвердження Інструкції з мікробіологічної діагностики туберкульозу

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАКАЗ

27.06.2019 № 1462

Зареєстровано в Міністерстві

юстиції України

08 серпня 2019 р.

за № 886/33857

Про затвердження Інструкції з мікробіологічної діагностики туберкульозу

Відповідно до підпункту 2 пункту 1 статті 6 Закону України «Про протидію захворюванню на туберкульоз», пункту 4 Положення про Міністерство охорони здоров'я України, затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 25 березня 2015 року № 267, та з метою ефективної діагностики випадків туберкульозу НАКАЗУЮ:

1. Затвердити Інструкцію з мікробіологічної діагностики туберкульозу, що додається.

2. Визнати таким, що втратив чинність наказ Міністерства охорони здоров'я України від 06 лютого 2002 року № 45 «Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозу»

3. Директорату громадського здоров'я (Скіпальський А.) забезпечити подання цього наказу в установленому законодавством порядку на державну реєстрацію до Міністерства юстиції України.

4. Контроль за виконанням цього наказу покласти на заступника Міністра з питань європейської інтеграції Стефанишину О.А.

5. Цей наказ набирає чинності з дня його офіційного опублікування.

В.о. Міністра

У. Супрун

ПОГОДЖЕНО:

Президент Національної академії

медичних наук України

Голова Державної регуляторної

служби України

Уповноважений Верховної Ради

України з прав людини

В. Цимбалюк

К. Ляпіна

Л. Денісова

ЗАТВЕРДЖЕНО

Наказ Міністерства охорони

здоров'я України

27 червня 2019 року № 1462

Зареєстровано в Міністерстві

юстиції України

08 серпня 2019 р.

за № 886/33857

ІНСТРУКЦІЯ

з мікробіологічної діагностики туберкульозу

I. Загальні положення

1. Ця Інструкція визначає детальний зміст та методику виконання мікробіологічних досліджень в лабораторіях, що здійснюють мікробіологічну діагностику туберкульозу, спрямовану на підвищення ефективності лікувально-діагностичного процесу, зменшення невиправданих витрат.

2. Ця Інструкція обов'язкова для виконання та поширюється на заклади охорони здоров'я державної та комунальної форм власності, які забезпечують забір, транспортування матеріалу та проведення мікробіологічних досліджень з метою діагностики туберкульозу.

3. У цій Інструкції терміни вживаються у таких значеннях:

мікроскопічне дослідження мазка мокротиння для виявлення КСБ - дослідження, що проводиться з метою виявлення найбільш небезпечних в епідеміологічному сенсі пацієнтів, хворих на туберкульоз легенів. Переваги мікроскопії, що полягають у швидкості отримання результату, відносній простоті, доступності дослідження й економічній ефективності, роблять її незамінною для виявлення більшості пацієнтів, хворих на туберкульоз легенів;

пряма мікроскопія - метод дослідження з необробленого діагностичного матеріалу або його осаду, якщо матеріал рідкий;

мікроскопія мазка з осаду - матеріал, що підготовлений для культурального дослідження після розрідження, деконтамінації, концентрації та ресуспендування;

кислотостійкі організми, у тому числі М. tuberculosis,- організми, що зберігають забарвлення карболовим фуксином після знебарвлення розчином сірчаної кислоти або солянокислого спирту; метод NALC-NаOH є методом деконтамінації, оскільки застосовується у разі посівів на щільних та рідких поживних середовищах, у тому числі в автоматизовані системи детекції мікобактерій. Під час правильного використання цей метод дозволяє отримати більше позитивних результатів культурального дослідження, ніж будь-який інший метод;

флуоресцентна мікроскопія - оптичне дослідження об'єктів, забарвлених спеціальними барвниками (флуорохромами), що світяться під дією ультрафіолетових променів;

молекулярно-генетичний метод - виявлення відмінностей у генетичній структурі чутливих і стійких штамів шляхом визначення нуклеотидних послідовностей генів, мутації, що призводять до виникнення резистентності M. tuberculosis до протитуберкульозних препаратів;

тест медикаментозної чутливості - визначення спектру чутливості мікобактерій туберкульозу до протитуберкульозних препаратів;

посів - метод виділення культури мікобактерій туберкульозу з біологічного матеріалу на щільних та рідких поживних середовищах;

внутрішній контроль якості бактеріологічних досліджень - ефективний і систематичний моніторинг та забезпечення відповідності усіх лабораторних процесів затвердженим стандартним операційним процедурам (далі - СОП) і встановленим стандартам.

II. Діагностичний матеріал для дослідження на туберкульоз

1. Для отримання достовірних результатів дослідження діагностичного матеріалу потрібно дотримуватися таких умов:

робити збір матеріалу до початку хіміотерапії, оскільки навіть декілька днів застосування медикаментозної терапії може бути достатньо для того, щоб убити значну кількість мікобактерій або понизити їх життєздатність і спотворити результати дослідження;

матеріал для дослідження має збиратися рано-вранці;

під час дослідження мокротиння потрібно зібрати дві проби ранкового мокротиння впродовж двох послідовних днів;

зібраний матеріал потрібно якнайшвидше доставити до лабораторій; у разі неможливості негайної доставки матеріал зберігається в холодильнику за температури +2-8 °C не більше ніж 72 год;

під час перевезення матеріалу потрібно особливо ретельно стежити за збереженням флаконів і правильністю їх маркування.

За відсутності можливості доставки зразків мокротиння для дослідження бактеріоскопії потрібно приготувати і доставити до лабораторії зафіксовані мазки.

Контейнер з порцією мокротиння достатнього об'єму (не менше ніж 3,0-5,0 мл), що містить ущільнені або гнійні грудочки без слини, ретельно закривають кришкою, що загвинчується, потім контейнер маркують і поміщають у спеціальний бікс для транспортування до лабораторії.

2. Для збору діагностичного матеріалу повинні використовуватись спеціальні контейнери, які:

прозорі, виготовлені з ударостійкого і прозорого матеріалу, що не допускає протікання рідини та дозволяє оцінити кількість і якість зібраної проби, не відкриваючи кришки;

легко піддаються маркуванню і надійно зберігають його протягом періоду зберігання, транспортування та проведення дослідження;

мають кришки, що загвинчуються з ущільненням (не використовувати флаконів, що мають кришки, які щільно закупорють його: під час відкриття таких кришок у контейнері виникає розріджений простір, який призводить до утворення аерозолю, створюючи потенційну небезпеку внутрішньолабораторного зараження);

мають об'єм 30,0-50,0 мл;

мають широкий отвір для збору мокротиння (не менше ніж 30,0 мм у діаметрі), щоб пацієнт міг легко відокремлювати мокротиння всередину контейнера, не піддаючи забрудненню його зовнішню поверхню.

Використання таких контейнерів дає можливість оцінити якість і об'єм зібраного матеріалу, а в разі приготування мазків з нативного мокротиння - проводити відбір гнійних грудочок приготування мазка безпосередньо з контейнера, запобігаючи етапу виливання мокротиння в чашку Петрі, надзвичайно небезпечного через утворення аерозолю. У цьому разі ефективність прямої мікроскопії може не поступатися ефективності мікроскопії з осаду.

3. Лабораторія, що проводить мікробіологічні дослідження з метою виділення M. tuberculosis, має бути готова отримати різноманітний біологічний матеріал на дослідження, а саме:

мокротиння;

виділення верхніх дихальних шляхів, після подразнюючої інгаляції;

промивні води бронхів;

бронхоальвеолярні змиви;

бронхоальвеолярний лаваж;

матеріал, отриманий під час бронхоскопії;

транстрахеальний та внутрішньолегеневий біоптати;

промивні води шлунка;

сечу;

пунктати із закритих порожнин (спинномозкову рідину, ексудати і транссудати з плевральної та черевної порожнин, гній, гнійно-некротичні маси, виділення ран, виділення відкритих порожнин тощо).

Якщо хворий не може відкашляти мокротиння, потрібно застосовувати інші методи (відхаркувальні препарати, подразнювальні аерозольні інгаляції, промивання трахеїв, бронхів тощо).

Індуковане мокротиння збирається у разі неможливості самостійного збору мокротиння пацієнтом. Для аерозольних інгаляцій користуються портативними або стаціонарними аерозольними інгаляторами.

Індуковане мокротиння нагадує на вигляд і за консистенцією слину, щоб уникнути вибраковування матеріалу на направленні і на флаконі з матеріалом має бути обов'язкове маркування, що вказує на те, що матеріал отримано після аерозольної інгаляції.

Під час дослідження промивних вод шлунка, щоб уникнути змішування мокротиння, що було проковтнуто з їжею, потрібно брати натщесерце. Останній прийом їжі має бути не менше ніж за 12 годин до взяття промивних вод шлунка.

Перед збором матеріалу пацієнту дають випити 100-150 мл стерильної дистильованої води. Отриманий матеріал нейтралізують додаванням 100 мг натрію бікарбонату, негайно доставляють в лабораторію і піддають обробці, щоб виключити пошкоджуючу дію на мікобактерії шлункових ферментів, що містяться в матеріалі.

Сеча (середня частина ранкової порції або вся ранкова порція) збирається в стерильний посуд після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Аналіз сечі на мікобактерії здійснюється тричі. У лабораторії сечу центрифугують за 3 000 g, використовуючи метод накопичення осаду.

Бактеріологічного дослідження добової сечі не проводять.

Асептично зібрані рідини (ліквор, перикардіальна, синовіальна, асцитична рідина, кров, кістковий мозок) мають збиратися лікарем в асептичних умовах у стерильний контейнер з використанням відповідних методик. До рідин, що мають схильність до згортання, додають стерильні гепарин (0,2 мг на 1,0 мл) або оксалат калію (0,01-0,02 мл 10,0 % нейтрального оксалату на 1,0 мл матеріалу). Матеріал має бути доставлено до лабораторії негайно.

Асептично зібрані тканини поміщаються в стерильні контейнери без додавання будь-яких консервантів. У разі тривалого транспортування тканини потрібно помістити в стерильний ізотонічний розчин, обкласти сухим льодом або охолодити за температури +4-8 °C. Матеріал має бути доставлено до лабораторії негайно.

Матеріал відразу після збору слід відправляти до лабораторії (протягом декількох годин). У разі віддаленості лабораторії від місця взяття матеріалу його відправка в лабораторію може здійснюватися два рази на тиждень. У цьому разі контейнери із зібраним матеріалом мають зберігатися в холодильнику за температури +4-8 °C не довше ніж 72 год. За потреби зберігання понад 72 год до діагностичного матеріалу додають консервант. У цьому разі термін зберігання збільшується до 5 діб.

Для інших матеріалів, якщо їх транспортування передбачається за високої температури навколишнього середовища або їх доставка до лабораторії більше, ніж через 24-72 год після збору (взяття), рекомендується використовувати такі хімічні консерванти:

10,0 % розчину тризаміщеного фосфату натрію;

1,0 % розчину цетилпіридин хлориду у 2,0 % хлориду натрію. М. tuberculosis залишаться життєздатними до 1 тижня;

подвійний об'єм 2,0-3,0 % розчину борної кислоти.

Зазначені розчини рекомендується застосовувати для збереження зразків мокротиння. У разі їх застосування матеріал може зберігатися за кімнатної температури. Однак консерванти токсичні для мікобактерій і їх застосування може знижувати висіюваність мікобактерій. Для зниження токсичності консервантів проби рекомендується зберігати в холодильнику за температури від +4 до +8 °C.

Діагностичний матеріал може бути заморожений, а в разі, якщо він не буде піддаватись розморожуванню і повторному заморожуванню, життєздатність мікобактерій збережеться.

4. Для безпечного транспортування дослідний матеріал має бути упаковано у водонепроникну ємність, що не б'ється, а також захищену від струсів, ударів та інших можливих пошкоджень.

Для транспортування матеріалу потрібно мати в лабораторії кілька спеціальних металевих або пластикових транспортувальних ящиків, які влаштовано так, щоб у вертикальному положенні фіксувати 20-30 контейнерів з діагностичним матеріалом. Кришка ящиків має надійно закриватися, щоб виключити можливість самовільного відкривання кришки і висипання контейнерів зі зразками. Для транспортування можна використовувати металеві бікси. Під час транспортування матеріал не повинен знаходитись на сонці.

На зразки, залежно від мети дослідження, та контейнери заповнюється направлення відповідно до чинного законодавства.

Усю зазначену супровідну документацію розміщають окремо від матеріалу (у файлі, конверті, поліетиленовому пакеті тощо), поза транспортним контейнером (ящиком/біксом) зі зразками.

Перед відправкою зібраного матеріалу медичний працівник повинен перевірити:

відповідність кількості контейнерів з мокротинням їх кількості, зазначеній у списку направлення;

відповідність номера кожного контейнера номерам, зазначеним у направленні.

Після перевірки даних супроводжувальної документації медпрацівник зазначають дату відправлення матеріалу на дослідження, ставить свій підпис та вкладає у файл (конверт, поліетиленовий пакет) супроводжувальний лист і заповнені бланки направлень на мікроскопічне дослідження на кожну пробу матеріалу та прикріплює конверт до транспортного контейнера (бікса, ящика) зовні.

5. Прийом матеріалу має забезпечуватися в спеціально відведеному місці. Бікси / транспортувальні ящики з контейнерами повинні відкривати у витяжній шафі або на спеціально виділеному столі з дотриманням таких вимог:

одягнути одноразові рукавички, контейнер відкривати у шафі біологічної безпеки;

провести зовнішню обробку бікса відповідним дезінфектантом;

обережно відкрити бікс і перевірити цілісність контейнерів. Биті контейнери знезаражують шляхом занурення в дезінфектант, кип'ятіння або автоклавування. Матеріал з таких зразків не досліджується. У цьому разі потрібно запросити новий зразок на аналіз;

витягнути контейнери з матеріалом із бікса. Провести обробку дезінфектантом зовнішніх поверхонь усіх контейнерів, що знаходяться у біксі;

продезінфікувати внутрішню частину бікса. Якщо виявлено забруднення бікса, проавтоклавувати його або занурити в дезінфікуючий розчин;

перевірити відповідність номерів у супроводжувальній документації номерам, що позначені на контейнерах із матеріалом;

присвоїти матеріалу лабораторний порядковий номер. Позначити відповідним номером контейнер (на бічній стінці) і внести номер до бланка направлення;

зняти рукавички і помістити їх у контейнер для дезінфекції, а потім вимити руки з милом.

У лабораторії має бути розроблено документально оформлені правила вибракування матеріалу, що передбачають:

відмову від під часйому первинних проб без потрібної ідентифікаційної документації та маркування;

належну поведінку стосовно проб незадовільної якості;

заходи в разі виявлення пошкоджених або негерметично закритих контейнерів.

Задовільна якість матеріалу передбачає наявність у матеріалі слизового або слизово-гнійного мокротиння. Об'єм зібраного матеріалу має коливатися в межах 3,0-5,0 мл, хоча в разі задовільної якості прийфнятна і менша кількість. Потрібно відзначити якість отриманого матеріалу в журналі реєстрації досліджень і в бланку видачі результатів дослідження. У разі вибракування матеріалу потрібно запросити нову порцію на дослідження.

Дослідження зразка виконуються тільки за наявності заповненої форми направлення. Неприпустимо проведення досліджень на підставі усного запиту, без відповідного письмового направлення.

Усі отримані первинні проби має бути зареєстровано у формах первинної облікової документації відповідно до направлення.

У день надходження до лабораторії консервованого матеріалу його центрифугують, відмивають стерильною дистильованою водою і без додаткової деконтамінації використовують осад для приготування мазків та посіву на живильні середовища.

III. Мікроскопічне дослідження для виявлення кислостійких бактерій

1. Метод мікроскопії є найбільш швидким, простим і менш витратним методом виявлення КСБ в нативному матеріалі (найчастіше в мокротинні) без попередньої його обробки й гомогенізації. Мікроскопічне дослідження мазків мокротиння, забарвлених за методом Ціля-Нільсена, дозволяє виявити КСБ за умови, що їх кількість буде складати 10 000 і більше в 1,0 мл мокротиння. Негативний результат не виключає діагнозу «туберкульоз», оскільки в мокротинні може міститися кількість мікобактерій нижча, ніж межа виявлення методом мікроскопії.

Основним діагностичним матеріалом для мікроскопії на КСБ слугує мокротиння.

Результати мікроскопічного дослідження на КСБ інших біологічних матеріалів (різних рідин, гною, сечі тощо) мають обмежене значення.

Дослідження мазків з осаду центрифугованої сечі не завжди дозволяє отримати достовірні результати, оскільки в сечі можуть бути наявні нетуберкульозні мікобактерії.

За потреби виявлення збудника туберкульозу в різних біологічних матеріалах рекомендується використовувати культуральний метод дослідження.

2. Процедура приготування мазка розпочинається з підготовки предметних скелець. Потрібно використовувати тільки одноразові, нові, без подряпин і сколів, знежирені у спирті або суміші Нікіфорова (96° етиловий спирт + ефір у співвідношенні 1 : 1). Скло підписують простим олівцем по матовій смузі або алмазним олівцем по склу. Номер, проставлений на скельці, має відповідати номеру дослідження в лабораторному реєстраційному журналі.

Під час приготування мазків із нативного матеріалу контейнер відкривають акуратно, уникаючи розбризкування аерозолю, що містить мікобактерії.

Мікобактерії частіше виявляються в щільних гнійних грудочках мокротиння.

Обпаленою в полум'ї спиртівки й охолодженою бактеріологічною петлею, одноразовою бактеріологічною петлею або зламаними кінцями дерев'яної палички (нової для кожної порції мокротиння) захоплюють невелику кількість мокротиння з гнійними грудочками. Щільно притиснувши петлю або паличку перпендикулярно до скла, дрібними круговими рухами розподіляють гнійну грудочку мокротиння по поверхні предметного скельця як можна тоншим шаром площею 1,0-2,0 см x 2,0-3,0 см у вигляді овалу.

Товщина мазка у висушеному незабарвленому стані має бути такою, щоб можна було прочитати газетний шрифт, розміщений за скельцем на відстані 5,0-10,0 см. Якщо мазок занадто тонкий, під час мікроскопічного дослідження можна отримати хибнонегативний результат. Якщо мазок занадто товстий, він може бути змитий з предметного скельця в разі забарвлення.

На одному предметному склі можна робити тільки один мазок.

Використані для приготування мазка палички чи одноразову бактеріологічну петлю скидають в ємність з дезінфікуючим розчином або в контейнер з відпрацьованим інфекційним матеріалом. Пінцет і ножиці обпалюють в полум'ї пальника (за потреби).

Приготування мазків для мікроскопічного дослідження є відносно небезпечною процедурою, під час якої може відбуватися розсіювання аерозолів, що містять збудник.

У разі якщо мазок готують за допомогою бактеріологічної петлі, потрібно обпалювати петлю після кожної маніпуляції в полум'ї спиртового чи газового пальника доти, доки вона не стане червоного кольору. Перед повторним використанням петлю ретельно прожарюють в полум'ї пальника, яке під час цьому має бути безбарвним чи блакитним. Принятніше використовувати одноразові бактеріологічні петлі.

Мазки з осаду отримують після центрифугування діагностичного матеріалу. Для приготування мазка до осаду додають 1,0 мл фосфатного буфера, ресуспендують. На скельце наносять 1-2 краплі ресуспендованого осаду, розподіляючи його тонким шаром у центрі скла на площі близько 1,0-2,0 см ґ 2,0-3,0 см.

Мазки з осаду рідкого матеріалу легко змиваються в процесі забарвлення, тому їх потрібно готувати на скельцях, заздалегідь оброблених сироваткою чи бичачим сироватковим альбуміном, який наносять ватним тампоном на чисті знежирені предметні скельця, рівномірно розподіляючи на 2/3 їх поверхні. Оброблені сироваткою скельця висушують за кімнатної температури. Скельця готують заздалегідь. Термін зберігання таких скелець - до 5 діб.

Не можна здійснювати приготування мазків способом «розтяжки» матеріалу між двома предметними скельцями, оскільки такий спосіб збільшує площу мазка більше ніж у 2 рази та знижує можливість виявлення КСБ.

Приготовані мазки висушують за кімнатної температури до висихання у витяжній шафі або шафі біологічної безпеки.

Не допускається підсушування або фіксації сирих мазків над полум'ям пальника.

Приготування, фіксацію, забарвлення і перегляд препаратів потрібно завершити до кінця робочого дня. Якщо дослідження не вдається завершити, предметні скельця з мазками залишають на ніч у закритій коробці. Нефіксовані мазки не повинні залишатися відкритими на ніч в робочому приміщенні.

3. Для фіксації мазків можна використовувати такі прийоми:

скельця з мазками, що висохли, фіксують триразовим проведенням їх упродовж 3-5 с через верхню третину полум'я спиртівки до зникнення ознак запотівання скелець;

скельця з мазками, що висохли, поміщають на електронагрівач для просушування предметних скелець за температури +65-75 °C не менше ніж на 1 год;

скельця з мазками, що висохли, поміщають у сушарну шафу за температури +105 °C на 10 хв.

4. Барвники, які використовуються, нерідко містять різні домішки, тому під час приготування розчинів барвників потрібно враховувати вміст фарбувальної речовини. Наважку розраховують шляхом ділення потрібної кількості фарби на десятковий еквівалент вмісту фарбувальної речовини.

Якщо вміст фарбувальної речовини становить 88,0 % і більше, перераховувати наважку не потрібно.

Кристали фенолу безбарвні, а якщо вони мають коричневий колір, їх не слід використовувати, оскільки в цьому разі якість забарвлення може бути незадовільною.

Реактиви:

Забарвлюючий розчин (3,0 % розчин фуксину).

Розчин 1. Розчин основного фуксину:

Основний фуксин

- 0,3 г

96° етиловий спирт

- 10,0 мл

Розчиняють основний фуксин у спирті.

Розчин 2. Розчин фенолу 5,0 % водний.

Кристалічний фенол

- 5,0 г

Дистильована вода

- 100 мл

Повільно нагрівають кристали фенолу у флаконі до рідкого стану на водяній бані і додають злегка підігріту дистильовану воду.

Робочий розчин:

Змішують 10,0 мл розчину 1 і 90,0 мл розчину 2, переливають у ємність із темного скла. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців. Перед використанням розчин слід профільтрувати.

Знебарвлюючий розчин (розчин 3,0 % солянокислого спирту):

Концентрована соляна кислота - 3,0 мл

96° етиловий спирт - 97,0 мл.

Акуратно додають концентровану соляну кислоту до спирту у флакон з темного скла. Забороняється вливати спирт у кислоту. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

Замість 3,0 % розчину солянокислого спирту для знебарвлення можна використовувати 25,0 % розчин сірчаної кислоти.

Знебарвлюючий розчин (розчин 25,0 % сірчаної кислоти):

Концентрована сірчана кислота - 25,0 мл

Дистильована вода - 75,0 мл

Акуратно додають концентровану сірчану кислоту до води, нашаровуючи її по стінці посудини.

Забороняється вливати воду в кислоту. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготуваня і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

Розчин, що дофарбовує (0,3 % розчин метиленового синього):

Хлорид метиленового синього - 0,3 г

Дистильована вода - 100 мл

Розчиняють хлорид метиленового синього в дистильованій воді.

На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

5. Промарковані й зафіксовані мазки поміщають на підставку («рейки») так, щоб вони не торкалися один одного. Не слід забарвлювати одночасно більше ніж 12 скелець.

На кожен мазок накладають смужку фільтрувального паперу. На всю поверхню фільтрувального паперу, що покриває скельце, наливають забарвлюючий розчин.

Повільно нагрівають препарат над полум'ям пальника до легкої появи парів. Не допускається закипання або повне випарювання забарвлюючого розчину на предметному скельці. Якщо розчину недостатньо, його треба додати і нагріти вдруге.

Прогрітий мазок залишають на 5 хв не допускаючи повного випарювання рідини, після чого фільтрувальний папір видаляють пінцетом і поміщають його в контейнер для відходів.

Кожне предметне скельце акуратно змивають під слабкою течією води до повного видалення забарвлюючого розчину. Не дозволяється змивати і знебарвлювати одночасно декілька мазків, щоб уникнути перехресної контамінації.

На скельця з мазками наливають знебарвлювальний розчин, повністю покриваючи всю поверхню мазка, і залишають на 3 хв.

Обережно промивають кожне предметне скельце, як зазначено вище. Знебарвлений мазок дофарбовують 0,3 % розчином метиленового синього впродовж 60 с.

Промивають скельця водою, видаляючи залишки вологи. Залишають препарат на повітрі за кімнатної температури у вертикальному або похилому положенні для висихання. Не слід промокати препарат.

6. Для налаштування мікроскопа і методики дослідження препаратів шляхом обертання макрогвинта віддаляють об'єктив від предметного столика. Обертаючи револьвер, встановлюють об'єктив із малим збільшенням (5 хв або 10 хв) точно над конденсором. Предметне скельце розміщують на предметному столику власне під об'єктивом. Дивлячись збоку для контролю відстані між склом і лінзою об'єктиву, повільно обертаючи мікрогвинт, опускають об'єктив до предметного скельця, не торкаючись лінзою препарату.

Дивлячись через окуляри, регулюють інтенсивність світлового потоку джерела світла.

Повертають макрогвинт так, щоб лінза об'єктиву відійшла від предметного столика, до отримання різкого зображення. Повертають мікрогвинт, щоб отримати чіткіше зображення.

Дивлячись на препарат збоку, вибирають об'єктив із великим збільшенням (100х). Слід переконатися, що об'єктив не торкається предметного скла. Аплікатором (піпеткою) наносять одну краплю імерсійної олії на препарат, не торкаючись скла. Щоб уникнути забруднення імерсійної олії й отримання хибноопозитивного результату, не можна торкатися піпеткою крапельниці олії до мазка. Крапля олії має вільно впасти на скельце. Опускають об'єктив до зіткнення з краплею олії. Повільно підіймають об'єктив до появи чіткого зображення. Налаштовують зображення, використовуючи мікрогвинт.

Для перегляду мазка під час мікроскопічного дослідження (додаток 1), забарвлених за методом Ціля-Нільсена, слід використовувати світловий бінокулярний мікроскоп з об'єктивом (100х) з масляною імерсією та окуляром (10х) (загальне збільшення 1 000х). Слід використовувати тільки синтетичну імерсійну олію з коефіцієнтом заломлення nD = 1,5.

Відповідними вважають поля зору, у яких видно клітинні елементи бронхіального походження (лейкоцити, слизові тяжі, клітини епітелію). Поля зору, що не містять таких елементів, не враховуються. Кількості полів зору якщо довжині мазка близько 2,0 см відповідає щонайменьше 100-120. У разі якщо результат такого дослідження виявляється негативним, для підтвердження рекомендується проглянути додатково ще 200 полів зору. Таким чином, вивчається 300 полів зору. У разі значної кількості КСБ у мазку (2+) досить дослідити 50 полів зору, а для мазка КСБ (3+) - досить проглянути 20 полів зору (додаток 1).

Після закінчення мікроскопічного дослідження кожного препарату для видалення імерсійної олії потрібно помістити мазок у витяжну шафу, накрити смужкою фільтрувального паперу і змочити її декількома краплями ксилолу. Через 2-3 хв фільтрувальний папір видаляють.

Очищений у такий спосіб від імерсійної олії препарат слід зберігати в коробці для позитивних або негативних препаратів, що були переглянуті раніше. Після перегляду кожного препарату слід ретельно протирати об'єктив мікроскопа від імерсійної олії безворсовими серветками, щоб запобігти контамінації наступного мазка. Серветки потім опускають у бак для відходів.

Кислотостійкі бактерії - тонкі малиново-червоні палички завдовжки 1-10 (частіше - 1-4) мкм, завширшки 0,2-0,6 мкм, злегка зігнуті, більш-менш зернисті. Мікобактерії розміщуються ізольовано, або парами, або у вигляді груп, добре помітні на блакитному фоні мазка.

Кислотостійкість, що виявляється під час забарвлення за Цілем-Нільсеном, властива не тільки різним видам мікобактерій, але й іншим мікроорганізмам, наприклад, Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а також цистам Cryptosporidium та Isospora. Мікобактерії, що швидко ростуть, можуть розрізнятися за мірою кислотостійкості. Іноді вони можуть забарвлюватися у фіолетово-малиновий колір. У сумнівних випадках рекомендується тривало (впродовж 45-60 хв) знебарвлювати мазок у солянокислому спирті. Сапрофіти під час цьому втрачають забарвлення і виглядають як палички блакитного кольору.

7. Кількість виявлених КСБ визначає тяжкість захворювання і міру епідемічної небезпеки хворого. Підраховують кількість КСБ у мазку. Отже, дослідження має бути не тільки якісним, але й кількісним. Реєстрація результатів із зазначенням кількості виявлених КСБ проводиться відповідно до градації результатів мікроскопічного дослідження під час забарвленні за методом Ціля-Нільсена (додаток 2).

8. Результати мікроскопічного дослідження вносять до лабораторного реєстраційного журналу обліку мікроскопічних досліджень та бланків направлення на дослідження.

Результати мікроскопії слід повідомляти до відділення, яке надало проби, якнайшвидше, бажано впродовж 24 год з моменту отримання проб мокротиння. У бланку результату дослідження має бути зазначено такі відомості:

паспортні дані пацієнта;

найменування установи виконавця і відправника;

характеристика якості матеріалу;

використаний метод забарвлення;

кількість КСБ у мазку;

дата дослідження і прізвище співробітника, який проводив дослідження.

Мазок із виявленими КСБ є документом, від якого залежить постановка діагнозу ТБ легень у конкретної людини. Його слід зберігати в лабораторії, а результати потрібно підтвердити повторним дослідженням.

9. Флуорохромні барвники (аурамін О, родамін С тощо) зв'язуються з воскоподібними структурами бактерійних клітин, які під час опромінення ультрафіолетовими променями візуалізуються як палички жовтого або помаранчевого кольору на темному фоні.

Перевага флуоресцентного методу мікроскопії полягає в можливості перегляду більшої площі мазка, що пов'язано з використанням об'єктива з меншим збільшенням.

Аурамін має канцерогенну активність, тому не слід допускати попадання на шкіру його порошку або розчину. Зважувати аурамін потрібно у вінілових рукавичках або двох парах звичайних рукавичок та захисних окулярах. Для захисту дихальної системи потрібно використовувати респіратор. Приміщення після зважування слід провітрювати. Готувати розчин і проводити забарвлення мазків варто тільки у витяжній шафі.

Під час забарвлення мазків флуорохромними барвниками потрібно:

уникати неповного знебарвлення;

готувати досить тонкі мазки, оскільки зайва товщина мазка перешкоджає якісному знебарвленню, а додаткове дофарбовування може під часховати наявність мікобактерій. Окрім цього, товсті мазки погано фіксуються на предметному скельці, а тому можуть бути змиті в процесі фарбування;

уникати надмірно інтенсивного дофарбовування, яке приховує наявність мікобактерій.

Оскільки із часом флуоресцентне забарвлення може зблідніти, мікроскопію роблять за можливості відразу ж після закінчення процедури забарвлення і висихання мазків. У разі неможливості проведення мікроскопії безпосередньо після фарбування допускається зберігання забарвлених мазків у темному місці, бажано в холодильнику, не більше ніж 24 год.

Реактиви:

1. Забарвлюючий розчин

Розчин 1. Спиртовий розчин аураміну О:

аурамін

- 0,1 г

Аурамін розчиняють у 96° етиловому спирті

- 10,0 мл

Розчин 2. Розчин фенолу:

фенол кристалічний

- 3,0 г

дистильована вода

- 87,0 мл

Кристали фенолу (температура плавлення - +41 °С) розчиняють у дистильованій у воді, підігріваючи на водяній бані.

Робочий розчин:

У витяжній шафі змішують розчини 1 і 2, переливають у ємність із темного скла, що щільно закривається. На етикетці зазначають назву реактиву, дату притування і термін зберігання.

Розчин можна зберігати в ємності з темного скла в прохолодному затемненому місці впродовж трьох місяців, у процесі зберігання розчин може стати каламутним, проте це не впливає на якість фарбування.

Знебарвлюючий розчин (розчин 0,5 % солянокислого спирту):

Концентрована соляна кислота - 0,5 мл

96° етиловий спирт - 100,0 мл

Акуратно додають концентровану соляну кислоту в етиловий спирт. Слід обережно влити кислоту в спирт, але не навпаки. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування, термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Для дофарбовування можна використовувати розчини перманганату калію, акридинового помаранчевого або метиленового синього.

Розчин перманганату калію:

Перманганат калію (КMnО4) - 0,5 г

Дистильована вода - 100 мл

Перманганат калію розчиняють у дистильованій воді і переливають у бутель з темного скла, який щільно закривається. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Розчин акридинового помаранчевого:

Безводний двозаміщений фосфат натрію (Na2HPO4) - 0,01 г;

Акридиновий помаранчевий - 0,01 г;

Дистильована вода - 100 мл.

Фосфат натрію розчиняють у дистильованій воді. Додають акридиновий помаранчевий. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Розчин метиленового синього:

Метиленовий синій хлорид - 25,0 мг;

Вода дистильована - 100 мл.

25,0 мг метиленового синього хлориду розчиняють у 100 мл дистильованої води. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

10. Промарковані й зафіксовані мазки поміщають на підставку («рейки») так, щоб вони не торкалися один одного. Не слід забарвлювати одночасно більше ніж 12 скелець.

На кожне скельце наливають крізь воронку з паперовим фільтром забарвлюючий розчин на 15-20 хв. Не слід підігрівати мазків і користуватися смужками фільтрувального паперу.

Промивають мазок дистильованою водою. Водопровідна вода містить з'єднання хлору, які можуть вплинути на флюоресценцію.

На скельце наливають знебарвлювальний розчин і залишають на 2 хв.

Промивають мазок дистильованою водою.

Знебарвлений мазок дофарбовують розчином перманганату калію, акридинового помаранчевого або метиленового синього з використанням воронки з паперовим фільтром упродовж 2 хв.

Промивають мазок дистильованою водою.

Залишають препарат на повітрі за кімнатної температури у вертикальному або похилому положенні для висихання. Не слід промокати препарат. Можливе висушування мазків у сухожаровій шафі малого об'єму впродовж 10 хв за температури +110 °C.

Під час використання перманганату калію час його дії не повинен перевищувати 2 хв.

Точність експозиції має вирішальне значення, оскільки в разі перевищення часу експозиції інтенсивність флуоресценції може зменшуватися.

11. Облік результатів мікроскопічного дослідження під час забарвлення флуорохромними барвниками здійснюється при значно меншому збільшенні (зазвичай 400х), ніж збільшення, яке використовується для перегляду мазків, забарвлених за методом Ціля-Нільсена (1000х). Тому поле зору, що переглядається під люмінесцентним мікроскопом, має значно більшу площу, ніж поле зору світлового мікроскопа. Отже, кількість КСБ у 100 полях зору препарату, забарвленого флуорохромами і переглянутого у разі збільшення в 400 разів, буде значно вищою, ніж під час дослідження цього самого препарату, забарвленого за Цілем-Нільсеном і переглянутого в разі збільшення в 1 000 разів.

Під час мікроскопії препарату, забарвленого флуорохромними барвниками, слід переглядати не менше ніж 40 полів зору. Переглянута площа мазка під час мікроскопії 40 полів зору зі збільшенням 400х дорівнює площі 100 полів зору зі збільшенням 1 000х або одній лінії мазка, рівній 2 см.

12. Внутрішній контроль якості мікроскопічного дослідження проводиться під час фарбування кожної партії мазків.

Із цією метою досліджуються контрольні (свідомо позитивні та негативні мазки), які готують заздалегідь, фіксують і зберігають у закритому контейнері.

Для підготовки контрольних мазків бажано використовувати справжні проби мокротиння, проте допустимо додавати до проб мокротиння суспензію М. tuberculosis (для позитивних мазків), кишкової палички чи інших некислотостійких паличок (для негативних мазків).

З кожного зразка мокротиння готують принаймні по 20 мазків, максимально ідентичних за розміром і товщиною, маркуючи кожну серію мазків одним і тим самим ідентифікаційним номером.

Мазки забарвлюють, переглядають 2–3 мазки з кожної серії, зазначають середню кількість КСБ для КСБ+ мазків у журналі контролю якості.

Позитивні і негативні контрольні мазки включають до кожної партії мазків, що будуть забарвлюватися. Мікроскопію контрольних мазків слід проводити перед мікроскопією мазків від пацієнтів.

Досліджують контрольні мазки, зазначають результати в журналі контролю якості, реєструючи номер партії барвника та/або дату приготування розчину.

Незадовільними результатами контролю мікроскопічного дослідження за Цілем-Нільсеном є такі:

у позитивному контрольному мазку КСБ забарвлені не яскраво або їх кількість занадто мала;

фон позитивного контрольного мазка залишається червоним;

у негативному контрольному мазку виявляються КСБ;

у мазках наявні конгломерати барвника.

Незадовільними результатами контролю мікроскопічного дослідження із забарвленням флуорохромами є такі:

у позитивному контрольному мазку КСБ забарвлені в неяскравий жовтий колір або їх кількість занадто мала;

фон негативного контрольного мазка залишається яскраво-жовтим після знебарвлення;

фон занадто темний або містить надто багато флуоресціюючих артефактів;

у негативному контрольному мазку виявляються КСБ.

Якщо під час проведення контролю якості відзначаються проблеми принаймні в одному із вищезазначених пунктів, слід з'ясувати, чи мали місце проблеми з притуванням розчинів, і повторити забарвлення двох негативних і двох позитивних контрольних мазків, зважаючи на можливі помилки. Якщо в разі повторного фарбування мають місце незадовільні результати, слід приготувати нові розчини барвників.

13. Причини, що знижують результативність мікроскопічного дослідження:

неправильне маркування флаконів із мокротинням (наприклад, під час маркування кришки флакона, а не власне флакона);

відсутність маркування на склі або пошкодження його в процесі забарвлення, помилки під час маркування зразків;

відсутність бінокулярного мікроскопа, поганий стан або погане налаштування мікроскопа;

недостатня підготовка персоналу;

технічні помилки під час запису або передачі результатів дослідження;

неправильна реєстрація результатів.

Неправильні результати можуть бути обумовлені помилками лабораторних працівників, пов'язаними переважно із фізичними і психологічними причинами (так званий «людський фактор»). Багато помилок, що виникають у разі неправильного обліку результатів мікроскопії мазків мокротиння, можна попередити під час здійснення постійного централізованого контролю роботи з мікроскопічної діагностики ТБ курируючими бактеріологічними лабораторіями за умови правильного навчання та періодичної перепідготовки лабораторних працівників.

14. Можливі причини хибнопозитивних результатів:

повторне використання контейнерів або предметних скелець;

розчин барвника приготований із використанням води, що містить сапрофітні мікобактерії;

використання непрофільтрованого розчину або забарвлюючого розчину, що зберігався впродовж тривалого часу;

недотримання методики фарбування мазків;

крос-контамінація КСБ внаслідок відсутності проміжків між сусідніми скельцями, що забарвлюються;

неадекватне знебарвлення;

неправильна інтерпретація результатів мікроскопії, коли внаслідок недоліку досвіду наявність у мазку кристалів погано профільтрованого барвника розцінюється як КСБ+;

поганий стан або погане налаштування мікроскопа;

контамінація імерсійної олії.

Можливі причини хибнонегативних результатів:

низька якість зразка мокротиння;

недостатній об'єм зразка мокротиння, узятого для підготовки мазка;

неправильний вибір грудочок мокротиння для приготування мазка;

порушення методики приготування мазка (занадто тонкий або товстий), погана його фіксація;

погана якість барвників;

недотримання методики приготування розчинів;

недостатній час експозиції із забарвлюючим розчином;

надмірне знебарвлення;

занадто сильне дофарбовування;

перегрівання в ході фарбування;

читання менше ніж 100 полів зору, хаотичний або недостатньо ретельний перегляд;

занадто тривала експозиція забарвлених мазків за денного освітлення;

занадто довгий інтервал між фарбуванням і читанням, особливо якщо мазки були погано забарвлені і не зберігалися в темряві.

IV. Обробка діагностичного матеріалу, деконтамінація та концентрація зразків

1. Проби клінічного матеріалу, що надходить до мікробіологічної лабораторії для бактеріологічного дослідження з метою діагностики і контролю хіміотерапії туберкульозу, різною мірою забруднені бактеріями, які швидко ростуть, а пишний їх ріст на багатих живильних середовищах заважає розвитку мікобактерій та ускладнює їх виділення. Тому перед посівом на живильні середовища діагностичний матеріал піддають спеціальній обробці, що забезпечує деконтамінацію, тобто загибель гноєрідної та гнилісної мікрофлори.

М. tuberculosis, що виділяються з дихальних шляхів хворого, оточені великою кількістю слизових речовин, що затрудняють їх виділення. Тому мокротиння та інші подібні матеріали перед посівом одночасно з деконтамінаціею піддають розрідженню й гомогенізації.

Усі препарати, що використовуються в певний час для розрідження і деконтамінації діагностичного матеріалу, мають виражену токсичність стосовно мікобактерій. Щоб забезпечити виживання достатньої частини мікобактеріальної популяції, потрібно використовувати бережні методи обробки, які дозволяють, з одного боку, подавити гнійні і гнилісні мікроорганізми, що швидко ростуть, а з другого - максимально зберегти життєздатність наявних у матеріалі мікобактерій.

Частота контамінації посівів (кількість проростів) у лабораторіях, де проводяться дослідження свіжозібраних проб, під час культивування мокротиння на щільних яєчних середовищах зазвичай становить 2,0-5,0 %. Якщо клінічний матеріал до надходження до лабораторії зберігався протягом декількох днів у нерегламентованих умовах, частота контамінації може досягати більше ніж 5,0 %, що припустимо. Якщо кількість проростів менше ніж 2,0 %, це свідчить про надмірно жорсткий режим деконтамінації, що може призвезти до загибелі значної кількості M. tuberculosis, які містяться в діагностичному матеріалі. Для уніфікації результатів дослідження потрібно, щоб мікробіологічні лабораторії використовували для гомогенізації й деконтамінації діагностичного матеріалу один зі стандартних методів, зазначених нижче.

Під час здійснення посівів на М. tuberculosis потрібно мати на увазі такі важливі аспекти:

клінічні зразки мають бути гомогенізовані, щоб звільнити М. tuberculosis з тканин, в яких вони можуть міститися;

ні гомогенізація, ні деконтамінація не повинні істотно зменшувати кількості життєздатних М. tuberculosis в діагностичному матеріалі;

успіх гомогенізації й деконтамінації залежить від ряду чинників, зокрема:

підвищеної стійкості мікобактерій до різко лужної або кислої реакції розчинів, які використано для гомогенізації матеріалу;

тривалості обробки матеріалу цими речовинами;

температури зразка в процесі його центрифугування;

ефективності центрифугування, яке використовується для осадження мікобактерій.

2. Процедура передпосівної обробки має бути максимально щадною й забезпечувати частоту контамінації не більше ніж 5,0 % для щільних середовищ і 8,0-10,0 % - для рідких.

Усю процедуру деконтамінації проводять тільки у шафах біологічної безпеки 2 класу. Оскільки потрібно суворо дотримуватися певної тривалості обробки матеріалу, доцільно одночасно обробляти не більше ніж 8-12 проб.

Для передпосівної обробки діагностичного матеріалу використовують тільки стерильні розчини детергентів, лугів і кислот. Для обробки й посіву матеріалу використовують тільки стерильний посуд (контейнери для збору діагностичного матеріалу, центрифужні пробірки, піпетки тощо).

Надосадову рідину, отриману в результаті центрифугування, зливають у контейнер з воронкою, що зменшує розбризкування рідини й утворення аерозолю. Використані піпетки поміщають у ємність з дезінфікуючим розчином або в пакети для автоклавування. Увесь забруднений лабораторний посуд з біологічними рідинами і використані витратні матеріали утилізуються автоклавуванням.

3. Усі реактиви, які використовують під час приготування розчинів для обробки діагностичного матеріалу, повинні мати ступінь очищення не менше ніж категорія «хімічно чисті» (ХЧ).

Для передпосівної обробки діагностичного матеріалу рекомендується використовувати нижчезазначені методи й реагенти.

4. Застосування муколітичного препарату NALC, що використовується для швидкого розрідження мокротиння, прискорює процес деконтамінації та зменшує концентрацію деконтамінуючої речовини (NAOH) до 1,0 %. NALС швидко втрачає свою активність в розчиненому вигляді, тому його розчин має готуватися щодня і вживатися свіжим. У муколітичну суміш входить цитрат натрію для зв'язування іонів важких металів, що можуть бути наявні в пробі й інактивувати дію N-ацетил-L-цистеїну.

NALC викликає тільки розрідження зразків мокротиння і не має деконтамінуючих властивостей. Тому для інших біологічних матеріалів (сеча, змиви, ліквор тощо) деконтамінацію слід проводити без додавання NALC (тільки розчином гідроксиду натрію й цитрату натрію).

Для отримання деконтамінуючого розчину, що містить 2,0 % NAOH (із цитратом натрію), потрібно з'єднати рівні об'єми 4,0 % розчину NAOH і 2,9 % розчину цитрату натрію безпосередньо перед використанням.

Розчини готують так:

розчин NAOH: 4,0 г NAOH розчинити в 100 мл дистильованої води;

розчин цитрату натрію: 2,9 г Na-цитрату дегідрату або 2,6 г Na-цитрату безводного розчинити в 100 мл дистильованої води.

Зазначені розчини стерилізують і зберігають в стерильному закритому посуді для подальшого використання.

Другий варіант приготуваннярозчину NaOH-цитрат - в 1,0 л дистильованої води розчинити:

гідроксид натрію (NAOH) - 20,0 г

цитрат натрію (Na3C6H5O7 ґ 2H2O) - 14,5 г.

Безпосередньо перед проведенням процедури обробки матеріалу готують робочий розчин деконтамінанту: у розчин NaOH-цитрат додають порошок муколітичного (розріджуючого) агента NALC із розрахунку 0,5 г на 100 мл розчину.

Суміш NALC-NaOH може бути використана тільки впродовж 24 год, оскільки після закінчення зазначеного терміну розчин швидко втрачає свою муколітичну активність. Тому рекомендується готувати невеликі об'єми розчину, щоб кожного разу використовувати для процедури деконтамінації свіжий розчин, не зберігаючи для подальшого використання об'єм розчину, що залишився.

У разі значного забруднення зразків сторонньою мікрофлорою концентрацію гідроксиду натрію у вихідному розчині можна збільшити до 3,0 %.

5. Для отримання фосфатного буфера (рН = 6,8) готують два розчини:

9,47 г безводного Na2HPO4 розчиняють в 10,0 мл дистильованої води;

9,07 г KH2PO4 розчиняють в 10,0 мл дистильованої води.

Потім для приготування буфера з рН = 6,8 обидва приготовані розчини змішують у рівній кількості й перевіряють рівень рН за допомогою рН-метра або індикаторної паперової смужки. Потрібного значення рН досягають, додаючи розчин а чи б. Розчин а підвищує значення рН, розчин б - знижує.

Другий варіант приготування буферного розчину: в 10,0 мл дистильованої води потрібно розчинити:

двозаміщений фосфат натрію (Na2HPO4) - 4,74 г;

однозаміщений фосфат калію (KH2PO4) - 4,54 г.

Стерилізація буфера проводиться в автоклаві за температури +121 °C протягом 15 хв у ємності з кришкою, що частково відкручена. Після охолодження розчину до кімнатної температури кришку слід щільно закрутити.

Обробку матеріалу слід проводити в ламінарній шафі біобезпеки з дотриманням стерильності за такою схемою:

до зразка (приблизно 5,0-10,0 мл), який міститься в пластиковій градуйованій центрифужній пробірці на 50,0 мл, додати рівний об'єм NALC-NaOH;

щільно закривши кришку, змішати вміст пробірки струшуванням або за допомогою вортексу (протягом 5-20 с) до повного розрідження;

перевернути пробірку, щоб усі ділянки її внутрішніх поверхонь і кришки піддалися дії розчину.

Потрібно уникати посиленого струшування, щоб запобігти окисленню й інактивації NALC. Необхідний ступінь інтенсивності змішування деконтамінуючого розчину з оброблюваним матеріалом забезпечується під час центрифугування, для чого потрібно:

залишити зразок на 15 хв за кімнатної температури для деконтамінації (у разі якщо потрібно збільшити ступінь деконтамінації, час експозиції може бути продовжено до 25 хв);

додати до пробірки стерильний фосфатний буфер (рН = 6,8) до відмітки «50,0 мл» (для зниження дії NAOH і зменшення щільності розчину перед центрифугуванням);

щільно закрити кришку й перемішати вміст пробірки струшуванням, щоб змити всі внутрішні поверхні пробірки і кришки;

центрифугувати зразок протягом 15-20 хв за 3 000 g в антиаерозольній центрифузі для осадження 95,0 % наявних у матеріалі мікобактерій;

перелити надосадову рідину в ємність з дезінфікуючим розчином за допомогою стерильної піпетки (або злити супернатант в ємність з дезінфектантом, після чого витерти край пробірки серветкою, змоченою дезінфектантом, або акуратно обпалити), а потім закрити пробірку.

Потрібно додати до осаду 0,5-2,0 мл нової порції стерильного фосфатного буфера, а потім ресуспендувати осад і використовувати його для інокуляції.

Розчин тризаміщеного фосфорнокислого натрію може використовуватися в 10,0 % концентрації.

Тризаміщений фосфорнокислий натрій (Na3PO4) добре пригнічує супутню флору і навіть при 2-3-денному зберіганні матеріалу за температури +4 °C не пошкоджує мікобактерій і мало впливає на їх здатність до росту на живильних середовищах.

Тризаміщений фосфорнокислий натрій може використовуватися для консервації, транспортування і деконтамінації зразків мокротиння. Метод не має жорстких обмежень за часом. Цей метод обробки матеріалу використовується тільки для посіву на щільні живильні середовища.

6. Для приготування розчину потрібно розчинити у 800 мл дистильованої води 100 г тризаміщеного фосфату натрію, довести об'єм розчину до 1 л і стерилізувати автоклавуванням протягом 15 хв за температури +121 °C.

Для обробки досліджуваний матеріал потрібно залити рівним об'ємом 10,0 % тризаміщеного фосфату натрію, щільно закрити ємність і помістити її на 10 хв на струшувач. Крім того, для кожного зразка бажано мати свою пробірку з Na3PO4 або окрему піпетку, щоб уникнути перехресної контамінації зразків під час заливання деконтамінуючого розчину.

Пробірку або флакон з матеріалом, залитим деконтамінантом, помістити на 18-20 год у термостат за температури +37 °C.

Після цього пробірки, не відкриваючи, помістити у відповідну центрифугу, урівноважити їх і центрифугувати під за 3 000 g протягом 15 хв. При зазначеному режимі відбувається осадження 95,0 % наявних у матеріалі мікобактерій.

Якщо процес деконтамінації проводився у контейнері, в якому матеріал надійшов до лабораторії, після закінчення деконтамінації осад матеріалу з контейнера слід перенести стерильною піпеткою об'ємом 5,0-10,0 мл у центрифужну пробірку, врівноважити пробірки й центрифугувати в описаному режимі.

Надосадову рідину відібрати стерильною піпеткою на 5,0-10,0 мл і перенести її в ємність з дезінфікуючим розчином, залишивши в кожній пробірці 1,2-1,5 мл осаду.

Використану піпетку опустити в ємність з дезінфікуючим розчином.

До осаду стерильно додати кілька крапель 6,0 % соляної кислоти або 1,0 % лимонної кислоти до отримання нейтрального значення рН, визначеного індикаторною паперовою смужкою.

Пробірку з осадом помістити у штатив в порядку реєстраційних номерів матеріалу.

Для зниження токсичного впливу на мікобактерії різних залишків речовин (у тому числі можливих хіміопрепаратів) проводять ще одну процедуру відмивання осаду 10,0-15,0 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Супернатант видаляють, а осад в об'ємі 0,8-1,0 мл готують до інокуляції й приготування мазка.

Під час проведення процедури деконтамінації потрібно пам'ятати, що центрифугування є однією з найбільш небезпечних процедур стосовно ризику утворення інфекційного аерозолю.

Процедури піпетування, переливання з ємності в ємність також має бути скорочено до мінімуму і здійснено у шафі біобезпеки.

Загальний час обробки матеріалу за методом Петрова не повинен перевищувати 40 хв.

Обробка за допомогою NaOH є досить жорсткою і може призвести до загибелі у зразку, що досліджується, до 60,0 % мікобактерій. Цей показник не залежить від додаткової загибелі бактерій за рахунок підвищеної температури під час центрифугування та інших факторів.

7. Розчин їдкого натру токсичний відносно як супутніх мікроорганізмів, так і М. tuberculosis. Тому під час використання цього методу потрібно суворо дотримуватися зазначених термінів обробки.

Приготування розчинів:

4,0 % розчин їдкого натру (NaOH):

40,0 г їдкого натру заливають дистильованою водою до об'єму 1 000 мл;

10,0 % розчин соляної кислоти:

10,0 мл концентрованої соляної кислоти додають до 90,0 мл дистильованої води.

Розчини стерилізують в автоклаві за температури +121 °C протягом 20 хв.

Для обробки досліджуваний матеріал, який перебуває в стерильному контейнері, залити подвійним об'ємом 4,0 % розчину їдкого натру і помістити на 10-30 с на струшувач.

Витримати отриману суміш 15 хв за кімнатної температури з періодичним ручним струшуванням. При цьому не варто перевищувати часу експозиції.

Стерильною піпеткою об'ємом 5,0-10,0 мл перенести оброблений матеріал у пробірки.

Пробірки врівноважити і центрифугувати матеріал за 3 000 g протягом 15 хв.

Стерильною піпеткою об'ємом 5,0-10,0 мл перенести надосадову рідину в ємкість з дезінфікуючим розчином, залишивши в пробірці 0,8-1,2 мл осаду.

До осаду додати стерильної піпеткою 15,0 мл стерильного 0,9 % розчину хлориду натрію.

Пробірки врівноважити і повторно центрифугувати матеріал за 3 000 g протягом 15 хв.

Стерильною піпеткою об'ємом 5,0-10,0 мл перенести надосадову рідину в ємність з дезінфікуючим розчином, залишивши в пробірці 1,2-1,5 мл осаду.

До осаду додати 0,5-1,0 мл буферного розчину для отримання нейтрального значення рН.

Закрити пробірку і струснути її вміст. Пробірку з осадом помістити в штатив, розмістивши її у порядку реєстраційних номерів матеріалу.

8. Стерильним пінцетом вносять тампон з мазком із носоглотки в стерильну пробірку для центрифугування (50,0 мл). Додають 2,0 мл стерильної дистильованої води. Проводять обробку матеріалу NALC-NаOH. Перед додаванням фосфатного буфера тампон виймають із пробірки.

9. Дослідження промивних вод шлунка має бути проведено впродовж перших 4 год після їх отримання від пацієнта, оскільки через високу кислотність М. tuberculosis можуть швидко загинути. Зазвичай під час дослідження промивних вод шлунка немає потреби здійснювати деконтамінацію, якщо пробу було взято в стерильний контейнер з дотриманням правил асептики. Увесь об'єм проби центрифугують за 3 000 g впродовж 30 хв. Відразу ж після цього роблять посів матеріалу на живильне середовище.

10. З метою виділення мікобактерій із сечі до зразка рекомендують додавати:

на об'єм до 20,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 1 краплю 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,1 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми);

на об'єм 20,0-30,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 2 краплі 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,3 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми);

на об'єм 30,0-50,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 3 краплі 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,5 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми).

Проби сечі залишають на 2 год у холодильнику за температури +2 °C. Зразки, об'єм рідини в яких перевищує 30,0 мл, слід розділити порівну на дві пробірки. Зразки центрифугують за 3 000 g впродовж 20 хв, зливають надосадову рідину. Потім обробку матеріалу проводять за методикою деконтамінації мокротиння (NaLC-NaOH), після чого негайно роблять посів на живильне середовище. Дослідження бактеріоскопії осаду сечі на КСП проводити недоцільно.

10. Лімфатичні вузли, біоптати та інші тканини, резецировані під час хірургічного втручання, потрібно подрібнити за допомогою стерильного скальпеля або ножиць і пінцета. Зразок гомогенізують у стерильній фарфоровій ступці або в гомогенізаторі тканин, додавши 0,5-1,0 мл стерильного ізотонічного розчину хлориду натрію і, за потреби, невелику кількість стерильного піску. Цю суспензію можна використати для посіву на живильне середовище у тих випадках, коли зазначені вище маніпуляції було проведено з дотриманням правил асептики. Якщо правил асептики не дотримувалися, проводять деконтамінацію проби 4,0 % розчином сірчаної кислоти, як це рекомендують робити під час обробки сечі. Якщо отриманий матеріал не може бути відпрацьований у день отримання проби, до зразка потрібно додати рівну за об'ємом кількість (не менше ніж 1,0 мл) стерильного ізотонічного розчину, щоб запобігти висиханню тканини. Зберігати матеріал у такому вигляді можливо не більше ніж 48 год у холодильнику за температури +4 °C.

11. Гній обробляється так само, як і аспіровані рідини. Якщо гній дуже густий, його слід обробляти так само, як мокротиння.

12. Стерильно взяту спинномозкову рідину засівають без попередньої обробки.

Якщо стерильність зразка викликає сумніви, можна обробити його за методикою, описаною для мокротиння. Рекомендується проводити посів на рідкі живильні середовища. Якщо дозволяє об'єм зразка, доцільно розділити його на дві частини, посіявши одну з них без обробки, іншу - після обробки.

13. Слизово-гнійні рідини обробляють так само, як і мокротиння, коли об'єм проби становить 10,0 мл або менше.

14. Якщо матеріал отримано з дотриманням правил асептики, його центрифугують за 3 000 g впродовж 15 хв і відразу ж роблять посів осаду на живильне середовище. Якщо об'єм проби перевищує 10,0 мл, її обробляють так само, як промивні води шлунка.

15. Кров та інші рідкі матеріали з великою домішкою крові після додавання 3,0 % розчину лимоннокислого натрію центрифугують за 3 000 g, а осад тричі відмивають стерильною дистильованою водою.

М. tuberculosis можуть «приклеюватися» до скла або пластику. Щоб досягти максимального витягання мікобактерій, контейнер обполіскують стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію. Центрифугують розчин за 3 000 g впродовж 15 хв і роблять посів 2-3 крапель осаду на живильне середовище.

16. Близько 5,0 г калу переносять у пробірку. Заливають гіпернасиченим розчином NaCl (у розчині має міститися нерозчинена сіль) і залишають на 4 год у ШББ. Зразок фільтрують через стерильну марлю в центрифужну пробірку, центрифугують за 3 000 g упродовж 20 хв, зливають надосадову рідину. До осаду додають 0,3 % розчин хлорамфеніколу в пропорції 1 : 3. Зразок поміщають на ніч у холодильник за температури +2 °C. Потім проводять обробку матеріалу за методикою деконтамінації мокротиння (NaLC-NaOH). Посів проводять як на щільні, так і в рідкі живильні середовища. Дослідження бактеріоскопії осаду калу на КСБ проводити недоцільно.

17. Під час внутрішньолабораторного контролю якості деконтамінації та оцінки можливих причин контамінації зразка, слід уточнити, чи не був занадто великим інтервал між збором зразка і його обробкою. Якщо це так, потрібно вжити заходів для організації транспортування зразків.

Потрібно суворо дотримуватися часу контакту зразка з деконтамінантом. Короткий час контакту призводить до високої частоти контамінації, занадто тривалий контакт викликає втрату життєздатності мікобактерій.

Потрібно переконатися, що ротор досягає необхідну відносну силу центрифугування 3 000 g і підтримує її впродовж 15 хв.

Контамінація може мати місце серед зразків, оброблених протягом одного дня або серед деконтамінованих зразків, зібраних у якому-небудь одному місці. У таких випадках слід перевірити стерильність розчинів для деконтамінації, виконання процедури деконтамінації чи організацію системи збору і транспортування зразків. Якщо виявлено помилки, слід прийняти негайні корегувальні дії. Якщо виявлено проблеми у виконанні процедури, слід провести навчання співробітників лабораторії, які виконують деконтамінацію.

Якщо має місце контамінація зразків від одного і того самого пацієнта, потрібно використовувати жорсткішу процедуру деконтамінації для обробки зразків від цього пацієнта. Треба збільшити концентрацію реактиву, але не термін обробки, використавши два об'єми розчину для деконтамінації одного об'єму зразка. Таку жорстку процедуру слід застосовувати тільки для обробки контамінованих зразків.

Крос-контамінація зразків від епідеміологічно не пов'язаних між собою пацієнтів може призвести до серії позитивних результатів бактеріологічного дослідження за короткий проміжок часу. У таких випадках слід оцінити можливість крос-контамінації для виключення хибнопозитивних результатів дослідження. Потрібно з'ясувати такі обставини:

чи мають пацієнти, які отримали позитивний результат культурального дослідження, клінічні симптоми туберкульозу;

чи отримано позитивний результат культурального дослідження під час дослідження інших зразків від тих самих пацієнтів;

чи не було оброблено один або декілька зразків із ростом одиничних колоній M. tuberculosis відразу після зразків із великою кількістю КСБ.

Якщо крос-контамінацію не може бути виключено, слід переконатися, що процедури виконуються правильно, зокрема такі:

деконтамінації зразків не проводиться паралельно з посівом культур мікобактерій;

під час внесення розчинів у пробірки не відбувається торкання шийки;

розчини реагентів діляться на аліквоти;

аліквотів розчинів, відкритих упродовж робочого дня, не використовують повторно;

зразки з високою вірогідністю КСБ+ обробляються і засіваються в останню чергу;

контейнери або пробірки зі зразками не відкриваються до того, як будуть закриті попередні;

контейнери або пробірки зі зразками не відкриваються безпосередньо після діставання із центрифуги;

надосадова рідина акуратно зливається в контейнер, що містить дезінфікуючій розчин, уникаючи розпліскування, наприклад, через воронку;

рукавички в ході роботи змінюють часто і ніколи не використовують повторно.

Тестування якості деконтамінації з використанням референс-штаму проводять із використанням референс-штаму мікобактерій. Можна використати будь-який доступний референс-штам або добре вивчений клінічний ізолят мікобактерій.

Прийнятніше використати швидкорослі НТМБ (M. fortuitum тощо). Під час проведення тестування оцінюється швидкість і рясність зростання деконтамінованої й необробленої суспензії мікобактерій.

Тестування проводиться щомісяця, кожного разу під час зміни реагентів, в разі незадовільних результатів контролю якості - щотижня.

Готують суспензію M. fortuitum у 2,0 мл стерильного фосфатного буфера за стандартом каламутності McFarland 1.

Суспензія 1: 0,1 мл суспензії вносять у 9,9 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Суспензія 2: 1,0 мл суспензії 1 вносять у 9,0 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Засівають по 0,2 мл суспензії 1 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена. Засівають по 0,2 мл суспензії 2 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

Залишки суспензії 1 і суспензії 2 піддають повній процедурі деконтамінації і центрифугування. Осад суспензії 1 ресуспендують в 1,0 мл стерильного буферу (суспензія 3). Осад суспензії 2 ресуспендують в 1,0 мл стерильного буферу (суспензія 4).

Засівають по 0,2 мл суспензії 3 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена. Засівають по 0,2 мл суспензії 4 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

Засівають по 0,2 мл суспензії 4 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

18. Через 5-7 днів інкубації оцінюють рясність росту M. fortuitum.

У пробірках, засіяних суспензією 1, має бути отримано густий ріст M. fortuitum (3+), у пробірках, засіяних суспензією 2,- помірний ріст (2+).

У пробірках, засіяних суспензіями 3 і 4, має бути отримано такий самий ріст (3+, 2+) або на ступінь нижче (2+, 1+).

У разі використання іншого референс-штаму слід проводити облік густоти росту після закінчення терміну, достатнього для появи видимого росту цього референс-штаму.

Процедурам деконтамінації й центрифугування піддають пробірку із середовищем Middlebrook 7Н9 чи ізотонічним розчином хлориду натрію, засіяну E. coli. Через 3 дні оцінюють наявність росту E. coli в контрольній пробірці та інших пробірках, оброблених одночасно, з метою встановлення можливої крос-контамінації.

Можна піддати процедурам деконтамінації й центрифугування незасіяну пробірку із середовищем Middlebrook 7Н9 чи ізотонічним розчином хлориду натрію. Через 3 дні оцінюють наявність росту в контрольній пробірці.

19. Для оцінки рівня контамінації визначають питому вагу контамінованих пробірок від загального числа засіяних пробірок для кожного живильного середовища. Така оцінка проводиться щомісяця, а в разі неадекватного рівня контамінації чи незадовільних результатів контролю якості - щотижня. Розрахунок рівня контамінації проводять за такою формулою:

Допустимий рівень контамінації для посівів у рідкі живильні середовища становить 6,0-8,0 %.

Високий рівень контамінації може бути викликано такими причинами:

недостатній час деконтамінації;

низька концентрація NaOH, NALC;

розчин NALC-NaOH приготований більше ніж 24 год тому;

незадовільна якість реагентів;

проблеми з референс-штамом (нежиттєздатний, неправильна каламутність суспензії);

нестерильні розчини.

Низький рівень контамінації, відсутність росту або незначний ріст культур мікобактерій може бути спричинено такими факторами:

перевищення часу деконтамінації зразків більше ніж на 20 хв;

завищена концентрація NaOH, NALC;

незадовільна якість реагентів;

проблеми з референс-штамом (нежиттєздатний, неправильна каламутність суспензії);

не належний рівень рН (вище ніж 8);

не належний режим центрифугування (час, швидкість, температура).

20. У випадках відхилення рівня контамінації від норми слід переконатися, що в лабораторії дотримуються таких вимоги внутрішнього контролю якості:

належні якість, термін придатності, концентрації реагентів і розчинів;

приготований робочий розчин використовується впродовж 24 год;

pH розчинів і зразка після деконтамінації не перевищує 8,0;

термін експозиції з деконтамінуючим розчином не перевищує 20 хв;

розчини і живильні середовища стерильні;

належна якість стерилізації в автоклаві й сухожаровій шафі;

належна якість контрольного штаму M. fortuitum.

У разі будь-якого відхилення від задовільних показників деконтамінації слід проаналізувати отримані результати й можливі причини цього.

Якщо в період, за який зареєстровано відхилення рівня контамінації, результати внутрішнього контролю якості живильних середовищ, обладнання і внутрішнього контролю якості деконтамінації, проведеної з використанням тест-штаму, були задовільними, змін до методики деконтамінації не вносять, а спостерігають за рівнем контамінації під час використання нової партії середовища.

Якщо мають місце незадовільні результати внутрішнього контролю якості деконтамінації, негайно здійснюють заходи для підвищення якості методу.

V. Живільні середовища, посіви та культивування

1. Для посіву діагностичного матеріалу використовують живильні середовища, серед яких можна виділити такі основні групи:

щільні живильні середовища на яєчній основі;

щільні або напіврідкі живильні середовища на агаровій основі;

рідкі живильні середовища;

рідкі синтетичні й напівсинтетичні живильні середовища.

Кожне із цих середовищ має свої переваги й недоліки. Оптимальне середовище для культивування M. tuberculosis має бути недорогим, простим у приготуванні, складатися з доступних компонентів. Крім того, середовище має пригнічувати ріст супутньої мікрофлори, забезпечувати хороший ріст під час посіву невеликої кількості мікобактерій і можливість попередньої диференціації колоній, що виросли, за морфологічними ознаками. Тобто оптимальне середовище повинне мати добрі інгібуючі, ростові й диференційні властивості. Яєчні середовища найбільшою мірою відповідають вище зазначеним вимогам у разі проведення посіву з мокротиння.

2. Переваги яєчних середовищ:

економічність (найбільш дешеві зі всіх середовищ, що використовуються для виділення мікобактерій) і простота приготування;

можуть зберігатися в холодильнику до 4 тижнів;

добре підтримують ріст більшості штамів М. tuberculosis;

дозволяють проводити попередню ідентифікацію мікобактерій за морфологією колоній;

малахітовий зелений, що входить до складу середовищ, пригнічує ріст супутньої мікрофлори, яка швидко росте, зменшуючи вірогідність контамінації посівів.

3. Недоліки яєчних середовищ:

поява росту мікобактерій упродовж 2-12 тижнів і довше;

у процесі культивування з'являється ріст супутньої мікрофлори, який спостерігається на всій поверхні живильного середовища, внаслідок чого ці пробірки потрібно відбраковувати. Для бактеріологічної діагностики ТБ потрібно використовувати щонайменше два різні за складом живильні середовища - Левенштейна-Єнсена і Фінна-II.

4. Середовище Левенштейна-Єнсена - щільне яєчне середовище, на якому хороший ріст М. tuberculosis одержують приблизно на 18-25 добу після посіву клінічного матеріалу з позитивним результатом мікроскопії на КСБ. До складу цього живильного середовища входить гліцерин, який сприяє росту M. tuberculosis. Для виділення M. bovis рекомендують варіант середовища Левенштейна-Єнсена, до складу якого замість гліцерину входить 0,5 % розчин пірувату натрію.

5. Середовище Фінна-II відрізняється від середовища Левенштейна-Єнсена тим, що замість L-аспарагіну в ньому використовується глутаміновокислий натрій (глутамат натрію) і склад солей розрахований так, що кінцева кислотність середовища має нижчі показники (рН 6,3-6,5), ніж у середовищі Левенштейна-Єнсена (рН 7,2-7,4), і більшу стабільність. Ці властивості обумовлюють більш високу ефективність середовища під час посіву матеріалу, обробленого лужними детергентами.

Ріст мікобактерій спостерігається на цьому середовищі на декілька днів раніше, ніж на середовищі Левенштейна-Єнсена, а відсоток виділення культур на 6,0-8,0 % вищий.

6. Вода для приготування живильних середовищ має бути дистильованою, вільною від речовин, що можуть сповільнити ріст мікроорганізмів.

Дистильовану воду зберігають у контейнерах, виготовлених із інертних матеріалів (наприклад, з нейтрального скла, поліетилену тощо), які мають бути вільними від будь-яких інгібуючих речовин.

Усі реактиви, що використовують для приготування живильних середовищ, повинні мати ступінь очищення не менше ніж категорія «ХЧ».

Посуд для приготування живильних середовищ має бути досить великого об'єму, щоб було зручно перемішувати середовище. Не слід готувати в одній ємності більше ніж 2,0 л середовища.

Під час приготування середовища потрібно використовувати хімічно чистий лабораторний посуд, а також щойно приготовлену дистильовану воду. Усі живильні середовища чутливі до нагрівання, тому не потрібно нагрівати їх довше, ніж цього потребує така процедура.

Для отримання якісного середовища й уникнення забруднення його сторонньою мікрофлорою рекомендують дотримуватися таких основних правил:

приміщення, де готують живильні середовища, утримують у максимальній чистоті. Рекомендують регулярно мити підлогу з додаванням дезінфікуючого засобу, а також протирати дезінфектантом обладнання й робочі поверхні. Перед приготуванням середовищ потрібно обробити приміщення УФ-опромінювачем;

використовувати тільки стерильний посуд;

використовувати потрібну кількість реагентів;