Про затвердження Методів відбору зразків та лабораторних досліджень (випробувань) для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю

Тип: Наказ

№ 8

Дата: 31 серпня 2026 р.

Статус: Не набрав чинності

МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ ТА ПРОДОВОЛЬСТВА УКРАЇНИ

НАКАЗ

31.08.2026

м. Київ

N 8

Зареєстровано в Міністерстві юстиції України

06 жовтня 2026 р. за N 1329/46723

Про затвердження Методів відбору зразків та лабораторних досліджень (випробувань) для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю

Відповідно до частини четвертої статті 21 Закону України "Про державний контроль за дотриманням законодавства про харчові продукти, корми, побічні продукти тваринного походження, здоров'я тварин та благополуччя тварин", цілі 24 розділу 12 "Безпечність харчових продуктів, ветеринарна та фітосанітарна політика" Кластеру 5 "Ресурси, сільське господарство та політика згуртованості" Національної програми адаптації законодавства України до права Європейського Союзу (acquis ЄС), затвердженої постановою Кабінету Міністрів України від 01 квітня 2026 року N 438, пункту 8 Положення про Міністерство аграрної політики та продовольства України, затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 06 серпня 2026 року N 1029,

НАКАЗУЮ:

1. Затвердити Методи відбору зразків та лабораторних досліджень (випробувань) для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю, що додаються.

2. Цей наказ набирає чинності з 01 травня 2027 року.

3. Контроль за виконанням цього наказу залишаю за собою.

Міністр аграрної політики та

продовольства України

Тарас ВИСОЦЬКИЙ

ПОГОДЖЕНО:

Міністр

охорони здоров'я України

Віктор ЛЯШКО

В. о. Голови Державної служби

України з питань безпечності

харчових продуктів

та захисту споживачів

Олег ОСІЯН

ЗАТВЕРДЖЕНО

Наказ Міністерства аграрної політики та продовольства України

31 серпня 2026 року N 8

Методи

відбору зразків та лабораторних досліджень (випробувань) для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю

I. Загальні положення

1. Ці Методи встановлюють:

процедури відбору зразків для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю;

методики підготовки зразків та лабораторних досліджень (випробувань) для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю.

2. У цих Методах терміни вживаються у таких значеннях:

абсолютне відновлення - вихід аналіту на кінцевій стадії процесу дослідження (випробування), поділений на кількість аналіту у вихідному зразку, виражений у відсотках;

аналіт - компонент системи, що підлягає дослідженню (випробуванню);

валідація - підтвердження шляхом дослідження та надання переконливих доказів того, що конкретні вимоги визначеного цільового використання виконані, шляхом дослідження в одній лабораторії або спільного дослідження;

вимірювана величина - конкретна кількість, що підлягає вимірюванню;

відновлення - відношення скоригованої на відновлення кількості аналіту до збагаченої кількості аналіту в зразку матриці, виражене у відсотках;

відносний матричний ефект - різниця в аналітичній відповіді між стандартом, розчиненим у розчиннику, та матрично-відповідним стандартом, з поправкою за допомогою внутрішнього стандарту;

відтворюваність - прецизійність за умов, коли результати досліджень (випробувань) отримано тим самим методом на ідентичних досліджуваних об'єктах у різних лабораторіях різними виконавцями з використанням різного обладнання;

внутрішній стандарт (IS) - речовина, яка не міститься у зразку та має фізико-хімічні властивості, максимально подібні до властивостей аналіту, який необхідно ідентифікувати або кількісно визначити;

внутрішньолабораторна відтворюваність або проміжна прецизійність / внутрішня відтворюваність - прецизійність вимірювання за набору внутрішньолабораторних умов у

конкретній лабораторії;

дозволена речовина - фармакологічна діюча речовина, дозволена до застосування тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, відповідно до законодавства та з дотриманням встановлених умов застосування;

дослідження в одній лабораторії або внутрішня валідація - дослідження (випробування), що проводиться в одній лабораторії з використанням одного методу дослідження (випробування) тих самих або різних випробувальних матеріалів за різних умов протягом обґрунтованих тривалих інтервалів часу;

досліджувана частина зразка - кількість матеріалу, що відібрана зі зразка, на якій проводиться дослідження (випробування) або спостереження;

еталонний матеріал - матеріал, достатньо однорідний та стабільний за однією або кількома визначеними властивостями, який, як було встановлено, є придатним для використання за призначенням у процесі вимірювання або при дослідженні номінальних властивостей;

ефект матриці - різниця в аналітичній відповіді між стандартом, розчиненим у розчиннику, та матрично-відповідним стандартом, або без корекції за допомогою внутрішнього стандарту, або з корекцією за допомогою внутрішнього стандарту;

залишки фармакологічних діючих речовин, що перевищують максимальний рівень (ML) - наявність залишків фармакологічних діючих речовин у продуктах тваринного походження, що є результатом неминучого перенесення цих речовин у нецільовий корм, у концентрації, що перевищує максимальні рівні, встановлені законодавством;

залишки фармакологічних діючих речовин, що перевищують максимальну межу залишків (MRL) - наявність залишків дозволених фармакологічних діючих речовин у продуктах тваринного походження в концентрації, що перевищує максимальні межі залишків, встановлені законодавством;

збагачений матеріал зразка - зразок, збагачений відомою кількістю аналіту, який необхідно виявити або визначити кількісно;

зміщення - різниця між розрахунковим значенням результату дослідження (випробування) та прийнятим еталонним значенням;

калібрувальний стандарт - простежуваний еталон для вимірювань, який представляє кількість досліджуваної речовини таким чином, що її значення пов'язує з еталонною базою;

кількісний метод - метод дослідження (випробування), який визначає кількість або масову частку речовини таким чином, щоб її можна було виразити у вигляді числового значення у відповідних одиницях;

коефіцієнт покриття (k) - число, яке виражає бажаний рівень достовірності та яке пов'язане з розширеною невизначеністю вимірювання;

контрольні значення для вжиття заходів (RPA) - рівні залишків фармакологічних діючих речовин, встановлені з метою контролю речовин, для яких не встановлені максимальні межі залишків;

корекція на відновлення - використання внутрішніх стандартів, калібрувальної кривої матриці, коефіцієнта корекції на відновлення, а також комбінації цих підходів;

ко-хроматографія - метод, за якого невідома речовина наноситься на хроматографічний носій разом з однією або декількома відомими сполуками, в очікуванні, що відносна поведінка невідомої та відомої речовин допоможе в ідентифікації невідомої речовини;

критерії ефективності - вимоги до характеристики ефективності, за якими можна визначити, що метод дослідження (випробування) є придатним для використання за призначенням та дає достовірні результати;

матриця - матеріал, з якого береться зразок;

матрично-відповідний стандарт - порожня (тобто без аналіту) матриця, до якої аналіт додається в діапазоні концентрацій після обробки зразка;

матрично-збагачений стандарт - порожня (тобто без аналіту) матриця, до якої перед екстракцією розчинником і обробкою зразка додається аналіт у діапазоні концентрацій;

межа рішення для підтвердження (CCa) - межа, за якої та вище якої можна з імовірністю похибки a зробити висновок, що зразок не відповідає вимогам, а значення 1 - a означає статистичну достовірність у відсотках того, що дозволену межу було перевищено;

метод скринінгу - метод, що використовується для скринінгу речовини або класу речовин на рівні інтересу;

міжлабораторне дослідження - організація, виконання та оцінка лабораторних досліджень

(випробувань) того самого зразка (зразків) двома або більше лабораторіями відповідно до заздалегідь визначених умов для оцінки ефективності лабораторних досліджень (випробувань), або як спільне дослідження, або як професійне тестування;

можливість виявлення для скринінгу (CCb) - найменший вміст аналіту, який може бути виявлений або кількісно визначений у зразку з ймовірністю похибки b:

у випадку заборонених або недозволених фармакологічних діючих речовин, CCb - найнижча концентрація, за якої метод здатний виявити або кількісно визначити, зі статистичною достовірністю 1 - b, зразки, що містять залишки заборонених або недозволених речовин;

у випадку дозволених речовин, CCb - концентрація, за якої метод здатний виявити концентрації, нижчі за дозволену межу, зі статистичною достовірністю 1 - b;

найнижчий калібрований рівень (LCL) - найнижча концентрація, за якою було відкалібровано вимірювальну систему;

невизначеність вимірювання - невід'ємний параметр, пов'язаний із результатом вимірювання, який характеризує розкид значень, які можна обґрунтовано віднести до вимірюваної величини на основі використаної інформації;

недозволені речовини - фармакологічні діючі речовини, які не включені до таблиці 1 Показників безпечності харчових продуктів "Максимальні межі (рівні) залишків діючих речовин ветеринарних препаратів у харчових продуктах тваринного походження", затверджених наказом Міністерства охорони здоров'я України від 23 грудня 2019 року N 2646, зареєстрованих у Міністерстві юстиції України 14 січня 2020 року за N 42/34325, або речовини, які не дозволені до використання як кормові добавки відповідно до Закону України "Про безпечність та гігієну кормів";

партія тварин - група тварин одного виду, в тому самому віковому діапазоні, вирощених на тому самому господарстві, в той самий час і в однакових умовах вирощування;

підтверджувальний метод - метод, який надає повну або додаткову інформацію, яка дозволяє однозначно ідентифікувати речовину та, за необхідності, кількісно визначити її одним із таких способів:

за максимальним рівнем залишків або максимальним рівнем для дозволених речовин;

за контрольними значеннями для вжиття заходів (RPA) щодо заборонених або недозволених речовин, для яких встановлено RPA;

за концентрацією настільки низькою, наскільки це можливо для забороненої або недозволеної речовини, для якої не встановлено RPA;

повторюваність - прецизійність за умов, коли незалежні результати досліджень (випробувань) отримуються тим самим методом на ідентичних досліджуваних об'єктах у тій самій лабораторії тим самим виконавцем з використанням того самого обладнання протягом коротких інтервалів часу;

похибка альфа (a) - ймовірність того, що випробуваний зразок відповідає вимогам, навіть якщо отримано невідповідний результат вимірювання;

похибка бета (b) -ймовірність того, що випробуваний зразок справді не відповідає вимогам, навіть якщо отримано відповідний результат вимірювання;

правильність - ступінь наближення середнього значення, отриманого з великої серії результатів досліджень (випробувань), до прийнятого еталонного значення;

прецизійність - ступінь близькості узгодженості між незалежними результатами дослідження (випробування), отриманими за встановлених умов, що виражається як стандартне відхилення або коефіцієнт варіації результатів дослідження (випробування);

речовина - матерія постійного складу, що характеризується елементами, що її складають, та певними фізичними властивостями;

рівень інтересу - концентрація речовини або аналіту в зразку, яка є значущою для визначення його відповідності законодавству щодо:

максимальної межі залишків або максимального рівня для дозволених речовин;

контрольного значення для вжиття заходів (RPA) для заборонених або недозволених речовин, для яких встановлено RPA;

концентрації настільки низької, наскільки це аналітично досяжно для забороненої або недозволеної речовини, для якої не встановлено RPA;

селективність - здатність методу розрізняти аналіт, що вимірюється, та інші речовини;

сертифікований еталонний матеріал (CRM) - еталонний матеріал, що супроводжується

документацією, виданою уповноваженим органом, і забезпечує одне або більше визначених значень властивостей із пов'язаними невизначеностями та простежуваністю, використовуючи валідовані процедури;

скринінгова цільова концентрація (STC) - концентрація, що нижча або дорівнює CCb, за якої скринінгове вимірювання класифікує зразок як потенційно невідповідний "позитивний скринінг" і запускає підтверджувальне тестування;

спільне дослідження - дослідження (випробування) того самого зразка (зразків) за допомогою того самого методу для визначення характеристик ефективності методу в різних лабораторіях, де дослідження дозволяє розрахувати випадкову похибку вимірювання та лабораторне зміщення для використаного методу;

стандартне додавання - процедура, за якої одна частина зразка досліджується (випробується) як така, а до інших досліджуваних частин зразка перед дослідженням (випробуванням) додаються відомі кількості стандартного аналіту;

стандартний аналіт - аналіт із відомим та сертифікованим вмістом та чистотою, який використовується як еталон в дослідженні (випробуванні);

стійкість - чутливість методу дослідження (випробування) до змін експериментальних умов, за яких метод може застосовуватись у представленому вигляді або з визначеними незначними модифікаціями;

точність - близькість відповідності між результатом дослідження (випробування) та прийнятим істинним еталонним значенням, визначеним шляхом оцінки правильності та прецизійності;

якісний метод - метод дослідження (випробування), який виявляє або ідентифікує речовину чи групу речовин на основі її хімічних, біологічних або фізичних властивостей.

Інші терміни вживаються у значеннях, наведених у Законах України "Про основні принципи та вимоги до безпечності та якості харчових продуктів", "Про державний контроль за дотриманням законодавства про харчові продукти, корми, побічні продукти тваринного походження, здоров'я тварин та благополуччя тварин", "Про ветеринарну медицину та благополуччя тварин".

3. Ці Методи є обов'язковими для:

державних ветеринарних інспекторів, державних інспекторів компетентного органу;

уповноважених лабораторій;

операторів ринку.

4. Відбір зразків для лабораторних досліджень (випробувань) на вміст залишків фармакологічних діючих речовин для цілей державного контролю здійснюється відповідно до методів, викладених у розділі II цих Методів.

5. Для цілей державного контролю залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, повинні використовуватися методи лабораторних досліджень (випробувань), критерії ефективності та інші вимоги до яких викладено в розділі III цих Методів.

6. Якість результатів досліджень (випробувань) для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю має бути забезпечена, зокрема, шляхом моніторингу досліджень (випробувань) або результатів калібрування відповідно до ДСТУ EN ISO/IEC 17025:2019 (EN ISO/IEC 17025:2017, IDT; ISO/IEC 17025:2017, IDT) "Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій" та вимог щодо контролю якості під час рутинного дослідження (випробування), викладених у підрозділі 8 розділу III цих Методів.

7. Інтерпретація результатів лабораторних досліджень (випробувань) для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю проводиться за такими правилами:

результат дослідження (випробування) вважається невідповідним, якщо він дорівнює або перевищує межу рішення для підтвердження (CCa);

для дозволених речовин, для яких встановлено MRL або ML, межею рішення для підтвердження (CCa) повинна бути концентрація, при якій та вище якої можна встановити зі статистичною достовірністю числового значення 1 - a, що дозволену межу перевищено;

для недозволених або заборонених речовин, або для дозволених речовин, для яких не було встановлено MRL або ML для конкретного виду або продукту, межею рішення для

підтвердження (CCa) повинен бути найнижчий рівень концентрації, при якому можна встановити зі статистичною достовірністю числового значення 1 - a, що конкретний аналіт присутній;

для недозволених або заборонених фармакологічних діючих речовин похибка a повинна становити 1 % або менше, для всіх інших речовин - 5 % або менше.

II. Методи відбору зразків

1. Відбір зразків здійснюється державними ветеринарними інспекторами, державними інспекторами компетентного органу з урахуванням вимог Порядку відбору зразків та їх перевезення (пересилання) до уповноважених лабораторій для цілей державного контролю, затвердженого наказом Міністерства аграрної політики та продовольства України від 11 жовтня 2018 року N 490, зареєстрованого у Міністерстві юстиції України 26 грудня 2018 року за N 1464/32916 (далі - наказ Мінагрополітики N 490), та засвідчується актом відбору зразків.

2. Мінімальні кількості зразків мають бути визначені в Плані державного моніторингу залишків фармакологічно діючих речовин та забруднюючих речовин у живих тваринах і необроблених харчових продуктах тваринного походження, затвердженому компетентним органом.

3. Мінімальні кількості зразків мають бути достатніми, щоб дозволити уповноваженим лабораторіям проводити аналітичні процедури, необхідні для завершення скринінгу та підтверджувальних лабораторних досліджень (випробувань).

Зокрема, для свійської птиці, рибних продуктів, вирощених в умовах аквакультури, кролів, диких тварин, вирощених на фермі, рептилій та комах зразок складається з однієї або кількох тварин, залежно від вимог методів лабораторних досліджень (випробувань).

Для яєць розмір зразка становить щонайменше 12 яєць або більше, відповідно до використовуваних методів лабораторних досліджень (випробувань).

Для страусиних яєць розмір зразка становить одне яйце.

Якщо кілька категорій речовин необхідно дослідити в одному зразку за допомогою різних методів лабораторних досліджень (випробувань), розмір зразка відповідно збільшується.

4. Якщо це не є технічно неможливим, кожен зразок має бути поділений щонайменше на дві еквівалентні частини зразка, кожна з яких дозволяє провести повну аналітичну процедуру. Поділ може відбуватися в місці відбору зразків або в лабораторії.

5. Кожен зразок має бути відібраний таким чином, щоб завжди можна було простежити його до ферми походження, партії тварин або окремої тварини, якщо це доречно. Зокрема, для молока, зразки можуть бути відібрані в одному з таких місць:

на фермі - з резервуара для збору молока;

на рівні переробної потужності - до того, як молоко буде вивантажено.

6. Зразки повинні бути відібрані у відповідні контейнери для забезпечення цілісності зразків та їхньої простежуваності. Зокрема, контейнери повинні запобігати заміні, перехресному забрудненню та псуванню.

7. Кожен зразок, відібраний для здійснення державного контролю, повинен бути опломбований (опечатаний) у місці відбору та ідентифікований відповідно до вимог законодавства.

8. Кожен відбір зразків засвідчується актом відбору зразків, що дозволяє однозначно ідентифікувати тварину або харчовий продукт, містить дату та місце відбору, а також іншу додаткову інформацію та складається за формою, затвердженою наказом Мінагрополітики N 490.

9. Акт відбору зразків складається у двох примірниках, що підписуються посадовою особою компетентного органу, яка відібрала зразки, та присутніми при відборі оператором ринку або уповноваженою ним особою та представниками відповідних державних органів у разі їхньої участі у відборі зразків. Один примірник акта залишається у посадової особи, яка здійснила відбір зразків та склала акт, другий - вручається оператору ринку або уповноваженій ним особі.

10. Відібрані зразки і копія акта відбору зразків передаються до уповноваженої лабораторії, визначеної посадовою особою компетентного органу.

11. Умови зберігання та транспортування мають бути визначені для кожної комбінації аналіту/матриці, щоб забезпечити стабільність аналіту, цілісність, ідентичність та простежуваність зразка.

Час транспортування повинен бути якомога коротшим, а температура під час

транспортування повинна бути достатньою для забезпечення стабільності аналіту.

Особливу увагу слід приділяти транспортним контейнерам, температурі та часу доставки до відповідальної лабораторії.

У разі недотримання вимог уповноважена лабораторія повинна негайно повідомити про це компетентний орган.

III. Методи лабораторних досліджень (випробувань) для цілей державного контролю

1. Загальні вимоги

1. Для цілей державного контролю залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, повинні використовуватися методи лабораторних досліджень (випробувань), що:

відповідають критеріям ефективності та іншим вимогам до методів лабораторних досліджень (випробувань), викладеним у підрозділі 2 цього розділу;

валідовані відповідно до вимог, викладених у підрозділах 3 - 7 та 9 цього розділу;

вони дозволяють забезпечити дотримання контрольних значень для вжиття заходів (RPA), виявлення наявності заборонених та недозволених речовин і забезпечення дотримання максимальних рівнів і максимальних меж залишків, встановлених законодавством.

2. Якщо під час валідації виявлено відхилення від критеріїв, встановлених у додатках 1 та 2 до цих Методів, вплив цих відхилень на результат валідації має бути проаналізований у документально простежуваний спосіб.

3. Лабораторні дослідження (випробування) для цілей державного контролю проводяться акредитованими лабораторіями, уповноваженими компетентним органом відповідно до вимог Закону України "Про державний контроль за дотриманням законодавства про харчові продукти, корми, побічні продукти тваринного походження, здоров'я тварин та благополуччя тварин".

4. Шляхом валідації методу має бути продемонстровано, що метод досліджень (випробувань) відповідає критеріям, що застосовуються до відповідних характеристик ефективності. Різні цілі контролю вимагають різних категорій методів. Класифікація методів досліджень (випробувань) за характеристиками ефективності, які необхідно визначити, наведена в додатку 3 до цих Методів.

2. Критерії ефективності та інші вимоги до методів лабораторних досліджень (випробувань)

1. До методів скринінгу застосовуються такі вимоги:

1) як категорії придатних методів скринінгу слід використовувати якісні, напівкількісні або кількісні методи;

2) до біологічних, біохімічних або фізико-хімічних методів скринінгу застосовуються такі вимоги:

для заборонених або недозволених речовин CCb має бути настільки низьким, наскільки це можливо, і в будь-якому випадку нижчим за контрольні значення для вжиття заходів (RPA) для речовин, для яких встановлено RPA;

для дозволених фармакологічних діючих речовин CCb має бути нижчим за максимальні рівні чи максимальні межі залишків;

для цілей скринінгу повинні використовуватися лише ті методи досліджень (випробувань), щодо яких можна продемонструвати у документально простежуваний спосіб, що вони валідовані та мають рівень хибно відповідних результатів нижчий або рівний 5 % (похибка b);

у разі підозри на невідповідність результату цей результат має бути підтверджений за допомогою підтверджувального методу;

3) кількісні методи скринінгу, що використовуються як для скринінгу, так і для підтвердження, повинні відповідати тим самим вимогам щодо точності, діапазону та прецизійності, як наведено у пункті 3 цього підрозділу.

2. До підтверджувальних методів застосовуються такі загальні вимоги:

1) для заборонених або недозволених речовин CCa має бути настільки низьким, наскільки це можливо. Для заборонених або недозволених речовин, для яких встановлено RPA, CCa має бути нижчим або дорівнювати контрольним значенням для вжиття заходів (RPA);

2) для дозволених речовин CCa має бути вищим за MRL або ML, але якомога ближчим до них;

3) для підтвердження слід використовувати лише методи досліджень (випробувань), для яких можна продемонструвати у документально простежуваний спосіб, що вони валідовані та мають коефіцієнт хибної невідповідності (похибка a), який менше або дорівнює 1 % для заборонених або недозволених речовин, чи менше або дорівнює 5 % для дозволених речовин;

підтверджувальні методи мають забезпечувати отримання інформації щодо структурного хімічного складу аналіту. Отже, підтверджувальні методи, що базуються лише на хроматографічному дослідженні (випробуванні) без використання мас-спектрометричного детектування, не можуть самостійно використовуватися як підтверджувальні методи щодо заборонених або недозволених фармакологічних діючих речовин. У випадку, якщо мас-спектрометрія не підходить для дозволених речовин, можна використовувати інші методи, такі як ВЕРХ-ДМД (HPLC-DAD) та ВЕРХ-ФД (HPLC-FLD), або їх комбінацію;

5) за потреби, згідно з підтверджувальним методом, відповідний внутрішній стандарт має бути доданий до досліджуваної частини зразка на початку процедури екстракції. Залежно від наявності, використовують або мічені стабільними ізотопами форми аналіту, які особливо підходять для мас-спектрометричного виявлення, або аналогові сполуки, які структурно близькі до аналіту;

6) якщо неможливо використати відповідний внутрішній стандарт, ідентифікацію аналіту бажано підтвердити за допомогою ко-хроматографії. У цьому випадку слід отримати лише один піковий сигнал, посилена висота (або площа) якого еквівалентна кількості доданого аналіту. Якщо це неможливо, слід використовувати матрично-збагачені або матрично-відповідні стандарти.

3. Для підтверджувальних методів застосовуються такі загальні критерії ефективності:

1) для повторних досліджень (випробувань) сертифікованого еталонного матеріалу відхилення експериментально визначеної середньої масової частки, скоригованої на відновлення, від сертифікованого значення має відповідати діапазонам мінімальної правильності кількісних методів, наведеним у додатку 1 до цих Методів;

2) якщо сертифіковані еталонні матеріали недоступні, оцінювати правильність вимірювань допустимо іншими способами, наприклад, використовуючи матеріали з установленими значеннями, отриманими з міжлабораторних досліджень, або додаючи відомі кількості аналіту(ів) до порожньої матриці;

3) коефіцієнт варіації (CV) для повторного дослідження (випробування) еталонного або збагаченого матеріалу за умов внутрішньолабораторної відтворюваності не повинен перевищувати рівень, розрахований за рівнянням Горвіца:

CV = 2(1 - 0,5 log C),

де C - масова частка, виражена у степені (показнику) 10 (наприклад, 1 мг/г = 10-3).

Для масових часток нижче 120 мкг/кг застосування рівняння Горвіца дає неприйнятно високі значення. Тому допустимий максимальний коефіцієнт варіації не повинен перевищувати значення, наведені в додатку 2 до цих Методів;

4) для досліджень (випробувань), проведених в умовах повторюваності, коефіцієнт варіації за умов повторюваності зазвичай становить менше двох третин значень, наведених у додатку 1 до цих Методів, і має бути меншим або рівним коефіцієнту варіації за умов відтворюваності.

4. Для хроматографічного розділення застосовуються такі вимоги:

1) для рідинної (РХ, LC) або газової хроматографії (ГХ, GC) мінімально допустимий час утримування аналіту(ів), що досліджуються, повинен бути вдвічі більшим за час утримування, що відповідає об'єму порожнини колонки;

2) час утримування аналіту в екстракті повинен відповідати часу утримування калібрувального стандарту, матрично-відповідного стандарту або матрично-збагаченого стандарту з допуском ± 0,1 хвилини. Для швидкої хроматографії, де час утримування менше 2 хвилин, прийнятним є відхилення менше 5 % від часу утримування;

3) у разі використання внутрішнього стандарту співвідношення хроматографічного часу утримування аналіту до часу утримування внутрішнього стандарту, тобто відносний час утримування аналіту, має відповідати часу утримування калібрувального стандарту, матрично-відповідного стандарту або матрично-збагаченого стандарту з максимальним відхиленням 0,5 % для газової хроматографії та 1 % для рідинної хроматографії для валідованих методів.

5. Для мас-спектрометрії застосовуються такі специфічні критерії ефективності:

1) мас-спектрометричне виявлення має здійснюватися з використанням одного або декількох із таких варіантів:

запис мас-спектрів повного сканування (FS);

моніторинг вибраних

іонів (SIM);

послідовна мас-спектрометрія (MSn), зокрема моніторинг вибраних реакцій (SRM);

комбінація методів мас-спектрометрії (MS) або послідовної мас-спектрометрії (MCn) з відповідними режимами іонізації;

2) доцільно використовувати як мас-спектрометрію низької роздільної здатності (LRMS, з роздільною здатністю одиниці маси), так і мас-спектрометрію високої роздільної здатності (HRMS), включаючи, наприклад, сектори подвійного фокусування, прилади для вимірювання часу прольоту (TOF) та аналізатори Orbitrap;

3) для підтвердження ідентичності аналіту в мас-спектрометрії високої роздільної здатності (HRMS) відхилення маси всіх діагностичних іонів має бути менше 5 ppm (або у випадку m/z

< 200 менше 1 mDa). На основі цього ефективну роздільну здатність слід вибирати відповідно до мети, і вона зазвичай має бути більше 10000 для всього діапазону мас при 10 % міжпікової впадини або 20000 при повній ширині на половині висоти (FWHM);

4) коли мас-спектрометричне визначення виконується шляхом запису повного сканування спектрів (як LRMS, так і HRMS), придатними є лише діагностичні іони з відносною інтенсивністю понад 10 % у еталонному спектрі калібрувального стандарту, матрично-відповідного стандарту або матрично-збагачених стандартів. Діагностичні іони повинні включати молекулярний іон (якщо присутній з інтенсивністю

≥ 10 % від базового піку) та характерні фрагментні або продукт-іони;

5) коли мас-спектрометричне визначення виконується шляхом фрагментації після відбору іонів-прекурсорів, відбір іонів-прекурсорів здійснюється з роздільною здатністю одиниці маси або вище. Вибраний іон-прекурсор має бути молекулярним іоном, характерними аддуктами молекулярного іона, характерними продукт-іонами або одним з їх ізотопних іонів. У випадку, якщо відбір прекурсорів має вікно відбору маси більше одного дальтона (наприклад, у випадку незалежного збору даних), метод вважається підтверджувальним дослідженням (випробуванням) повного сканування;

6) вибрані фрагментні іони або продукт-іони повинні бути діагностичним фрагментом для вимірюваного аналіту/продукту. Неселективні переходи (наприклад, катіон тропілію або втрата води) слід пропускати, коли це можливо. Кількість діагностичних іонів слід визначати за площею піку або висотою інтегрованих хроматограм екстрагованих іонів. Це також застосовується, коли для ідентифікації використовуються вимірювання повного сканування. Співвідношення сигнал/шум (S/N) усіх діагностичних іонів має бути більшим або рівним трьом до одного (3:1);

7) відносні інтенсивності діагностичних іонів (співвідношення іонів) виражаються у відсотках від інтенсивності найпоширенішого іона або переходу. Співвідношення іонів слід визначати шляхом порівняння спектрів або інтегрування сигналів слідів екстрагованих мас іонів. Співвідношення іонів аналіту, що підлягає підтвердженню, повинно відповідати співвідношенню матрично-відповідних стандартів, матрично-збагачених стандартів або стандартних розчинів у порівнюваних концентраціях, виміряних за тих самих умов, у межах відносного відхилення ± 40 %;

8) для всіх мас-спектрометричних досліджень необхідно визначити щонайменше одне співвідношення іонів. Як правило, використовуються іони, отримані під час одного сканування, але іони також можуть походити з різних сканувань під час одного введення (тобто повного сканування та фрагментаційного сканування);

9) для вибору відповідних методів отримання даних та критеріїв оцінки використовується система ідентифікаційних точок. Для підтвердження ідентичності речовин у матриці, для яких встановлено максимальну межу залишків (дозволене використання), потрібно щонайменше 4 ідентифікаційні точки. Для недозволених або заборонених речовин потрібно 5 ідентифікаційних точок. Одна точка може походити з хроматографічного розділення. Кількість ідентифікаційних точок, яку дає кожен із методів, наведено в додатку 4 до цих Методів. Ідентифікаційні точки, отримані за допомогою різних методів, можна додавати, щоб отримати кількість ідентифікаційних точок, необхідну для підтвердження;

10) усі мас-спектрометричні дослідження (випробування)

повинні поєднуватися з методом розділення, який забезпечує достатню розділювальну здатність та селективність для конкретного застосування. До придатних методів розділення належать, зокрема, рідинна та газова хроматографія, капілярний електрофорез (CE) та надкритична флюїдна хроматографія (SFC). У випадку аналіту, який представляє будь-яку ізобарну або ізомерну сполуку, прийнятність часу утримування (тобто ± 0,5 % у газовій хроматографії (GC) та ± 1 % у рідинній хроматографії (LC) та надкритичній флюїдній хроматографії (SFC)) є обов'язковою для підтвердження його ідентичності;

11) для досягнення мінімальної кількості ідентифікаційних точок можна поєднати максимум три окремі методи. Різні режими іонізації (наприклад, електронна іонізація та хімічна іонізація) вважаються різними методами.

6. Для визначення аналіту за допомогою рідинної хроматографії з використанням методів детектування, відмінних від мас-спектрометрії, застосовуються такі специфічні критерії:

1) тільки для дозволених речовин, як альтернативу методам на основі мас-спектрометрії, можна використовувати такі методи, за умови виконання відповідних критеріїв для цих методів:

спектрофотометричне детектування з повним скануванням діодної матриці (DAD) у випадку використання з ВЕРХ (HPLC);

флуоресцентне спектрофотометричне детектування (FLD) у випадку використання з ВЕРХ (HPLC);

2) рідинна хроматографія з UV/VIS детектуванням (одна довжина хвилі) сама по собі не підходить для використання в якості підтверджувального методу;

3) критерії ефективності хроматографічного розділення, зазначені у пункті 4 цього підрозділу, повинні бути виконані як критерії ефективності спектрофотометрії з повним скануванням діодної матриці;

4) максимуми поглинання в УФ-спектрі аналіту повинні бути на тих самих довжинах хвиль, що й калібрувальний стандарт у матриці, в межах максимального запасу, який визначається роздільною здатністю системи детектування. Для детектування за допомогою діодної матриці (DAD) цей максимальний запас зазвичай становить ± 2 nm. Спектр аналіту вище 220 nm для тих частин двох спектрів з відносним поглинанням, що перевищує або дорівнює 10 %, не повинен помітно відрізнятися від спектру калібрувального стандарту. Цей критерій вважається виконаним, коли, по-перше, присутні однакові максимуми, а по-друге, коли різниця між двома спектрами ні в якій точці не перевищує 10 % поглинання калібрувального стандарту. У випадку використання комп'ютеризованої бібліотеки, пошуку та зіставлення, порівняння спектральних даних у зразках для цілей державного контролю з даними калібрувального розчину повинно перевищувати критичний коефіцієнт збігу. Цей коефіцієнт визначається під час процесу валідації для кожного аналіту на основі спектрів, для яких виконуються критерії, описані у підпунктах 1 - 3 цього пункту. Необхідно перевіряти варіативність спектрів, спричинену матрицею зразка та роботою детектора;

5) критерії ефективності хроматографічного розділення, зазначені в пункті 4 цього підрозділу, повинні бути виконані як критерії ефективності спектрофотометрії з флуоресцентним детектуванням;

6) вибір довжин хвиль збудження та випромінювання в поєднанні з хроматографічними умовами має здійснюватися таким чином, щоб мінімізувати вплив компонентів, що заважають, в екстрактах порожніх зразків. Між довжинами хвиль збудження та випромінювання має бути щонайменше 50 нанометрів;

7) найближчий максимум піку на хроматограмі повинен бути відокремлений від визначеного піку аналіту принаймні на одну повну ширину піку на рівні 10 % від максимальної висоти піку аналіту;

8) вимоги підпунктів 5 - 7 цього пункту стосуються молекул, які демонструють природну флуоресценцію, та молекул, які демонструють флуоресценцію після трансформації або дериватизації.

3. Валідація: правильність, повторюваність та внутрішньолабораторна відтворюваність

1. У цьому підрозділі наведено приклади та посилання на процедури валідації. Для демонстрації відповідності методу критеріям ефективності можна використовувати інші підходи за умови, що вони забезпечують такий самий рівень та якість інформації.

2. Розрахунок

параметрів відповідно до загальноприйнятих методів вимагає проведення кількох окремих експериментів. У разі суттєвих змін необхідно перевірити поточну валідність характеристик ефективності. Для методів з кількома аналітами можна досліджувати кілька аналітів одночасно, за умови виключення можливих значущих перешкод. Декілька характеристик ефективності можна визначити аналогічним чином. Тому, щоб мінімізувати робоче навантаження, необхідно максимально поєднувати експерименти (наприклад, повторюваність та внутрішньолабораторна відтворюваність зі специфічністю, дослідження порожніх зразків для визначення межі рішення для підтвердження та перевірка специфічності).

3. Правильність методу дослідження (випробування) визначається за допомогою сертифікованого еталонного матеріалу (CRM) відповідно до процедури, визначеної ISO 5725-4:2020 або національним стандартом, прийнятим на його основі, за таким прикладом:

проведіть дослідження (випробування) шести повторів CRM відповідно до інструкцій з випробування для цього методу;

визначте концентрацію аналіту, присутнього в кожному зразку повторів;

обчисліть середнє значення, стандартне відхилення та коефіцієнт варіації (%) для цих шести повторів;

обчисліть правильність, поділивши виявлену середню концентрацію на сертифіковане значення (виміряне як концентрація) та помноживши на 100, щоб виразити результат у відсотках.

Правильність (%) = (виявлена середня концентрація, скоригована на відновлення) х 100 / сертифіковане значення.

4. Якщо сертифікований еталонний матеріал відсутній, правильність методу визначається експериментально з використанням збагаченої порожньої матриці, як мінімум, відповідно до наступної схеми:

1) для методів, валідованих з 01 травня 2027 року, виберіть порожній матеріал та збагачуйте його при концентрації:

0,5, 1,0 та 1,5 раза від RPA (якщо для забороненої або недозволеної фармакологічної діючої речовини валідація концентрації на рівні 0,5 RPA не є практично досяжною, концентрація на рівні 0,5 RPA може бути замінена найнижчою концентрацією в діапазоні від 0,5 до 1,0 RPA, яка є практично досяжною, або LCL, у випадку якщо він є нижчим за 0,5 RPA); або

0,1, 1,0 та 1,5 раза від максимальної межі залишків (MRL) або максимальний рівень (ML) для дозволених речовин (якщо для конкретної фармакологічної діючої речовини валідація концентрації на рівні 0,1 MRL не є практично досяжною, концентрація на рівні 0,1 MRL може бути замінена найнижчою концентрацією в діапазоні від 0,1 до 0,5 MRL, яка є практично досяжною); або

1,0, 2,0 та 3,0 рази від найнижчого калібрувального рівня (LCL) для недозволених речовин (для яких не було встановлено RPA);

2) на кожному рівні дослідження (випробування) має бути виконане у шести повторах;

3) проведіть дослідження (випробування) зразків;

4) обчисліть концентрацію, виявлену в кожному зразку;

5) розрахуйте правильність для кожного зразка, використовуючи рівняння, зазначене в абзаці другому цього підпункту, а потім обчисліть середню правильність та коефіцієнт варіації для шести результатів на кожному рівні концентрації.

Правильність (%) = (середня виявлена концентрація, скоригована на відновлення) х 100 / рівень збагачення.

5. Для методів для дозволених речовин, валідованих до 01 травня 2027 року, достатньо визначити правильність методу з використанням шести збагачених аліквот у концентраціях, що в 0,5, 1,0 та 1,5 раза перевищують максимальну межу залишків (MRL) або максимальний рівень (ML).

6. Визначення повторюваності для методів, валідованих з 01 травня 2027 року, здійснюється так:

1) має бути підготовлений набір зразків ідентичних порожніх матриць одного й того ж виду, що збагачуються аналітом для отримання концентрацій, еквівалентних:

0,1, 1,0 та 1,5 раза від максимальної межі

залишків (MRL) або максимальний рівень (ML) для дозволених речовин (якщо для конкретної фармакологічної діючої речовини валідація концентрації на рівні 0,1 MRL не є практично досяжною, концентрація на рівні 0,1 MRL може бути замінена найнижчою концентрацією в діапазоні від 0,1 до 0,5 MRL, яка є практично досяжною); або

1,0, 2,0 та 3,0 рази від найнижчого калібрувального рівня (LCL) для недозволених або заборонених речовин, якщо не застосовується RPA;

2) на кожному рівні дослідження (випробування) має бути виконане щонайменше у шести повторах;

3) проведіть дослідження (випробування) зразків;

4) обчисліть концентрацію, виявлену в кожному зразку;

5) розрахуйте середню концентрацію, стандартне відхилення та коефіцієнт варіації (%) збагачених зразків;

6) повторіть ці кроки щонайменше два рази, щоб отримати загалом щонайменше 18 повторень на кожному рівні;

7) розрахуйте загальні середні концентрації, стандартні відхилення (шляхом усереднення квадрата стандартного відхилення окремих випадків та взяття з цього квадратного кореня) та коефіцієнти варіації для збагачених зразків.

7. Для методів для дозволених речовин, валідованих до 01 травня 2027 року, достатньо визначення повторюваності зі збагаченими матрицями в концентраціях, що в 0,5, 1,0 та 1,5 раза перевищують максимальні межі залишків (MRL) або максимальні рівні (ML).

8. Альтернативно, розрахунок повторюваності можна виконати відповідно до процедури, визначеної ISO 5725-2:2019 або національним стандартом, прийнятим на його основі.

9. Визначення внутрішньолабораторної відтворюваності для валідацій, проведених після 01 травня 2027 року, здійснюється так:

1) підготуйте набір зразків зазначеного досліджуваного матеріалу (ідентичні або різні матриці), збагачених аналітом(ами) для отримання концентрацій, еквівалентних:

2) виконайте дослідження (випробування) на кожному рівні концентрації з щонайменше шістьма повтореннями порожнього матеріалу;

3) проведіть дослідження (випробування) зразків;

4) обчисліть концентрацію, виявлену в кожному зразку;

5) повторіть ці кроки щонайменше ще двічі (загалом щонайменше 18 повторень на кожен рівень) з різними партіями порожнього матеріалу, різними виконавцями та якомога більшою кількістю різних умов навколишнього середовища, наприклад, різними партіями реагентів, розчинників, різною температурою приміщення, різними приладами або варіацією інших параметрів;

6) визначте середню концентрацію, стандартне відхилення та коефіцієнт варіації (%) збагачених зразків.

10. Для методів щодо дозволених речовин, валідованих до 01 травня 2027 року, достатньо визначення внутрішньолабораторної відтворюваності зі збагаченими матрицями в концентраціях, що в 0,5, 1,0 та 1,5 раза перевищують максимальні межі залишків (MRL) або максимальні рівні (ML).

11. Альтернативно, розрахунок внутрішньолабораторної відтворюваності / проміжної прецизійності також можна виконати відповідно до процедур, визначених ISO 5725-2:2019 або національним стандартом, прийнятим на його основі, ДСТУ ISO 11843-1:2005 "Статистичний контроль. Здатність до виявлення. Частина 1. Терміни та визначення".

12. Розрахунок параметрів відповідно до альтернативних моделей вимагає впровадження експериментального плану. Експериментальний план має бути

розроблений залежно від кількості різних видів та факторів, що досліджуються. Відтак першим кроком усієї процедури валідації є розгляд популяцій зразків, які будуть досліджуватися в лабораторії в майбутньому, з метою визначення найважливіших видів та факторів, які можуть впливати на результати вимірювань. Факторний підхід дозволяє оцінити невизначеність вимірювання результатів випробувань, отриманих за різних умов випробувань у даній лабораторії, зокрема: таких як різні виконавці, різні прилади, різні партії реагентів, різні матриці, різна тривалість випробувань та різні температури випробувань. Потім діапазон концентрацій має бути обраний адаптованим до цілі способом відповідно до MRL або ML для дозволених речовин або RPA або LCL для заборонених або недозволених речовин.

13. Факторний підхід спрямований на встановлення достовірних даних прецизійності та даних вимірювань шляхом одночасної контрольованої варіації вибраних факторів. Він дозволяє оцінити комбінований вплив факторних та випадкових ефектів. Експериментальний план також дозволяє дослідити стійкість методу дослідження (випробування) та визначити стандартне відхилення внутрішньої відтворюваності для різних матриць. Зміни в експериментальних умовах, про які йдеться, можуть стосуватися матеріалів зразків, аналітів, умов зберігання, умов навколишнього середовища та/або умов підготовки зразків. Для всіх експериментальних умов, які на практиці можуть підлягати коливанням (наприклад, стабільність реагентів, склад зразка, pH, температура), необхідно вказати будь-які зміни, які можуть вплинути на результат дослідження (випробування).

14. Приклад альтернативного підходу з використанням ортогонального експериментального плану наведений у додатку 5 до цих Методів.

Можна дослідити до семи факторів (факторів шуму). Дослідження розроблено таким чином, що прецизійність, правильність (на основі збагачених зразків), чутливість, невизначеність вимірювання та критичні концентрації можна визначити одночасно шляхом реалізації експериментального плану.

15. Можуть бути використані інші підходи для підтвердження відповідності методу критеріям ефективності щодо характеристик ефективності, за умови, що вони забезпечують той самий рівень та якість інформації. Валідація також може здійснюватися шляхом проведення міжлабораторного дослідження відповідно до вимог Кодексу Аліментаріус, ISO або IUPAC, або відповідно до альтернативних методів, таких як дослідження в одній лабораторії або внутрішня валідація. При застосуванні альтернативних процедур валідації базова модель та стратегія з відповідними передумовами, припущеннями та формулами повинні бути викладені в протоколі валідації або принаймні повинні бути надані посилання на їх наявність.

4. Валідація: селективність / специфічність, стійкість та стабільність

1. Здатність розрізняти аналіт від близькоспоріднених речовин має бути визначена якомога точніше. Визначається вплив гомологів, ізомерів, продуктів розпаду, ендогенних речовин, аналогів, метаболічних продуктів залишкової речовини, що є об'єктом дослідження, матричних сполук або будь-якої іншої речовини, що може впливати на результат, і за необхідності, метод має бути змінений, щоб уникнути виявленого впливу.

2. Для визначення специфічності методу використовується такий підхід:

1) виберіть ряд хімічно споріднених сполук або інших речовин, які можуть зустрічаються разом зі сполукою, що є об'єктом дослідження, та які можуть бути присутніми у зразках, та перевірте, чи можуть вони перешкоджати дослідженню цільового(-вих) аналіту(-ів);

2) проведіть дослідження (випробування) відповідної кількості репрезентативних порожніх зразків, наприклад, різні партії або партії різних видів тварин (n

≥ 20), та перевірте наявність будь-яких впливів сигналів, піків або іонних слідів у досліджуваній області, де очікується елюювання цільового аналіту;

3) збагатіть репрезентативні порожні зразки у відповідній концентрації речовинами, які можуть потенційно перешкоджати ідентифікації та/або кількісному визначенню аналіту, та дослідіть, чи додана речовина:

може призвести до хибної

ідентифікації;

перешкоджає ідентифікації цільового аналіту;

суттєво впливає на кількісне визначення.

3. Метод дослідження (випробування) необхідно перевірити на предмет його постійної ефективності за різних експериментальних умов, які включають, наприклад, різні умови відбору зразків та незначні зміни, що можуть виникнути під час рутинних випробувань. Для перевірки стійкості методу зміни, внесені в експериментальні умови, повинні бути незначними. Важливість цих змін необхідно оцінити. Кожну характеристику ефективності необхідно визначити для всіх незначних змін, щодо яких було встановлено наявність значного впливу на ефективність визначення.

4. Стабільність калібрувального стандарту, матрично-відповідного стандарту та/або матрично-збагачених стандартів, а також аналіту або матричних компонентів у зразку під час зберігання або дослідження (випробування) необхідно визначати, оскільки нестабільність може вплинути на результати досліджень (випробувань).

Стабільність аналіту зазвичай добре характеризується за різних умов зберігання. Експерименти, проведені з метою моніторингу умов зберігання стандартів і зразків, які здійснюються в рамках звичайної системи акредитації лабораторій та контролю якості, можуть надати необхідну інформацію. Якщо дані про стабільність аналітів у матриці доступні (наприклад, на основі інформації від референтних лабораторій, опублікованих даних тощо), ці дані не потрібно визначати кожною лабораторією. Однак посилання на доступні дані про стабільність аналітів у розчині та в матриці є допустимим лише за умови застосування ідентичних умов.

5. Якщо необхідні дані щодо стабільності недоступні, слід застосовувати підходи, наведені в пунктах 6 - 8 цього підрозділу. Крім того, може бути використаний ізохронний підхід за схемою температури зберігання, аналогічною до наведеної в додатку 6 до цих Методів схеми визначення стабільності аналіту в розчині, що дозволяє визначити потенційну нестабільність аналіту, а також оцінити відповідні періоди зберігання.

6. Визначення стабільності аналіту в розчині здійснюється так:

1) приготуйте свіжі розчини аналіту(-ів) та розведіть їх відповідно до інструкцій з випробування, щоб отримати достатню кількість аліквот (наприклад, 40) кожної вибраної концентрації. Зразки повинні бути підготовлені з:

розчинів аналіту, які використовуються для збагачення;

розчинів аналіту, що використовуються для остаточного дослідження (випробування);

будь-яких інших розчинів, що представляють інтерес (наприклад, дериватизованих стандартів);

2) виміряйте вміст аналіту у свіжоприготованому розчині згідно з інструкціями з випробування;

3) розлийте відповідні об'єми у підходящі контейнери, маркуйте та зберігайте відповідно до умов освітлення та температури, наведених у додатку 6 до цих Методів. Тривалість зберігання слід вибирати з урахуванням застосованої аналітичної практики, в ідеалі до моменту спостереження перших ознак деградації під час ідентифікації та/або кількісного визначення. Якщо під час дослідження стабільності деградація не спостерігається, тривалість зберігання в рамках дослідження стабільності має дорівнювати тривалості максимального періоду зберігання розчину;

4) розрахуйте концентрацію аналіту(ів) у кожній аліквоті порівняно з концентрацією аналіту у свіжоприготованому розчині за такою формулою:

Залишок аналіту (%) = Ci х 100/Cfresh, де

Ci - концентрація в момент часу i;

Cfresh - концентрація свіжого розчину.

7. Середнє значення п'яти повторних розчинів, що зберігалися, не повинно відрізнятися більш ніж на 15 % від середнього значення п'яти свіжоприготованих повторних розчинів. Середнє значення п'яти свіжоприготованих розчинів використовується як основа для розрахунку відсоткової різниці.

8. Визначення стабільності аналіту(-ів) у матриці здійснюється так:

1) за можливості використовуйте зразки з природним вмістом аналіту. Якщо матриця з природним вмістом аналіту недоступна, слід використовувати порожню матрицю, збагачену аналітом;

2) якщо доступна матриця з природним вмістом аналіту, гомогенізуйте її, бажано, поки матриця ще свіжа. Розділіть матрицю на п'ять

частин та проведіть дослідження (випробування) однієї аліквоти з кожної частини;

3) якщо матриця з природним вмістом аналіту недоступна, візьміть порожню матрицю та гомогенізуйте її. Розділіть матрицю на п'ять частин. Кожна частина повинна бути збагачена аналітом приблизно на рівні інтересу, а аналіт бажано готувати у невеликій кількості водного розчину. Негайно проведіть дослідження (випробування) однієї аліквоти з кожної частини;

4) зберігайте частини (підзразки) гомогенізованої матриці з природним вмістом аналіту або збагаченої порожньої матриці за температури, що відповідає умовам зберігання, прийнятим у лабораторії для даної комбінації аналіту/матриці, та визначте концентрації аналіту після короткострокового, середньострокового та довгострокового зберігання (принаймні так довго, як зразок зазвичай зберігається в лабораторії);

5) середнє значення п'яти аліквот однієї частини зразка, яка зберігалася, не повинно відрізнятися від середнього значення п'яти свіжоприготованих аліквот більше, ніж на величину внутрішньолабораторної відтворюваності методу. Середнє значення п'яти свіжоприготованих аліквот використовується як основа для розрахунку відсоткової різниці;

6) зафіксуйте максимально допустимий час зберігання та оптимальні умови зберігання.

5. Валідація: межа рішення для підтвердження (CCa)

1. Межа рішення для підтвердження (CCa) визначається для підтверджувальних методів. CCa встановлюється за умов, що відповідають вимогам до ідентифікації або ідентифікації з кількісним визначенням, як визначено у підрозділі 2 цього розділу.

2. Для контролю відповідності зразків комбінована стандартна невизначеність вимірювання вже врахована у значенні CCa (межа рішення для підтвердження).

3. Для недозволених або заборонених фармакологічних діючих речовин CCa розраховується таким чином:

1) метод 1: за процедурою калібрувальної кривої відповідно до норм, визначених ДСТУ ISO 11843-1:2005 "Статистичний контроль. Здатність до виявлення. Частина 1. Терміни та визначення" (визначено як критичне значення чистої змінної стану). У цьому випадку використовується порожній матеріал, який збагачений на рівні RPA або LCL та вище з рівномірними кроками. Проведіть дослідження (випробування) зразків. Після ідентифікації побудуйте графік сигналу, якщо можливо, або перерахованої концентрації відносно доданої концентрації. Відповідна концентрація в точці перетину з віссю y плюс 2,33-кратне стандартне відхилення внутрішньолабораторної відтворюваності в точці перетину дорівнює межі рішення. Цей метод застосовується лише для кількісних досліджень (випробувань). Межі рішення, отримані за допомогою цього підходу, повинні бути перевірені шляхом дослідження (випробування) порожньої матриці, збагаченої на рівні розрахованої межі рішення;

2) метод 2: шляхом дослідження (випробування) щонайменше 20 репрезентативних порожніх зразків для кожної матриці, щоб мати змогу розрахувати співвідношення сигнал/шум у часовому вікні, в якому очікується аналіт. Трикратне співвідношення сигнал/шум може бути використане як межа рішення. Цей метод застосовується як до кількісних, так і до якісних досліджень (випробувань). Межі рішення, отримані за допомогою цього підходу, повинні бути перевірені шляхом дослідження (випробування) порожньої матриці, збагаченої розрахованою межею рішення;

3) метод 3: CCa = LCL + k (односторонній, 99 %) х (комбінована) стандартна невизначеність вимірювання на рівні LCL.

Для недозволених або заборонених фармакологічних діючих речовин, залежно від валідаційного експерименту (та його відповідних ступенів свободи), може бути доцільно застосувати t-розподіл, або - якщо за основу взято нормальний (гаусівський) розподіл (односторонній, n =

∞) - слід використовувати k-фактор 2,33.

Внутрішньолабораторна відтворюваність та правильність є придатними для визначення (комбінованої) стандартної невизначеності вимірювання, якщо вони визначаються з урахуванням усіх відповідних факторів впливу.

Для методів, валідованих до 01 травня 2027 року, для розрахунку CCa може використовуватися лише метод 2.

Для методів, валідованих після 01 травня 2027

року, слід використовувати лише метод 1 або 3.

4. Для дозволених речовин у комбінаціях матриця/вид, для яких встановлено MRL або ML, CCa розраховується таким чином:

1) метод 1: за процедурою калібрувальної кривої відповідно до норм, визначених ДСТУ ISO 11843-1:2005 "Статистичний контроль. Здатність до виявлення. Частина 1. Терміни та визначення" (визначено як критичне значення чистої змінної стану). У цьому випадку використовується порожній матеріал, який збагачується на рівні та вище MRL або ML з рівномірними кроками. Проведіть дослідження (випробування) зразків. Після ідентифікації побудуйте графік сигналу, якщо можливо, або перерахованої концентрації відносно доданої концентрації. Відповідна концентрація на рівні MRL або ML плюс 1,64-кратне стандартне відхилення внутрішньолабораторної відтворюваності на допустимій межі дорівнює межі рішення (a = 5 %);

2) метод 2: CCa = MRL (або ML) + k (односторонній, 95 %) х (комбінована) стандартна невизначеність вимірювання на рівні MRL або ML;

3) для дозволених речовин, залежно від валідаційного експерименту (та його відповідних ступенів свободи), може бути доцільно застосувати t-розподіл, або - якщо за основу взято нормальний (гаусівський) розподіл (односторонній, n =

∞) - слід використовувати k-фактор 1,64;

4) внутрішньолабораторна відтворюваність та правильність є придатними для визначення (комбінованої) стандартної невизначеності вимірювання, якщо вони визначаються з урахуванням усіх відповідних факторів впливу;

5) для фармакологічних діючих речовин, для яких MRL встановлено для суми різних речовин, CCa речовини з найвищою концентрацією у зразку використовується як CCa для оцінки суми речовин у виміряному зразку.

5. Для дозволених речовин у комбінаціях матриця/вид, для яких встановлено MRL, залишки не повинні бути присутніми, якщо не було проведено дозволене відповідно до вимог законодавства лікування. Для дозволених речовин, для яких не встановлено MRL, для розрахунку CCa використовується каскадний MRL. Застосовується метод 1 або 2, зазначений у підпунктах 1, 2 пункту 4 цього підрозділу, але "MRL" означає "0,5-кратний каскадний MRL, з цільовим показником 0,1-кратний каскадний MRL, де це обґрунтовано можливо".

6. Валідація: можливість виявлення для скринінгу (CCb)

1. Значення CCb визначається для методів скринінгу. Значення CCb встановлюється, як визначено у підрозділі 2 цього розділу, та відповідно до вимог, викладених у додатку 3 до цих Методів. Вимоги до ідентифікації, які визначені у пунктах 4 - 6 підрозділу 2 цього розділу, не обов'язково застосовувати для методів скринінгу.

2. Для недозволених або заборонених фармакологічних діючих речовин максимальна похибка b має бути забезпечена на рівні 5 %. CCb розраховується таким чином:

1) метод 1: за процедурою калібрувальної кривої відповідно до норм, визначених ДСТУ ISO 11843-1:2005 "Статистичний контроль. Здатність до виявлення. Частина 1. Терміни та визначення" (визначено як мінімальне виявлюване значення чистої змінної стану). У цьому випадку використовується репрезентативний порожній матеріал, який збагачений на рівні та нижче RPA, або, якщо RPA не встановлено, навколо STC з рівномірними кроками. Проведіть дослідження (випробування) зразків. Побудуйте графік залежності сигналу від доданої концентрації. Відповідна концентрація при STC плюс 1,64-кратне стандартне відхилення внутрішньолабораторної відтворюваності середнього виміряного вмісту при STC дорівнює можливості виявлення. Екстраполяція значно нижча найнижчого рівня збагачення (

< 50 % найнижчого рівня збагачення) повинна бути підтверджена експериментальними даними на етапі валідації;

2) метод 2: дослідження збагаченого порожнього матеріалу на рівні концентрації початково обраного стандартного рівня концентрації STC. На цьому рівні концентрації необхідно провести дослідження (випробування) 20 збагачених порожніх зразків, щоб забезпечити надійну основу для цього визначення. Якщо на цьому рівні концентрації залишається

≤ 5 % хибно відповідних результатів, рівень дорівнює можливості виявлення методу. Якщо отримано

> 5 % хибно відповідних

результатів, обраний STC слід збільшити, а дослідження повторити для перевірки відповідності вимозі

≤ 5 % хибно відповідних результатів;

3) метод 3: CCb = STC + k (односторонній, 95 %) х (комбінована) стандартна невизначеність вимірювання на рівні STC або вище.

∞) - слід використовувати k-фактор 1,64.

3. Для дозволених речовин максимальна похибка b має бути забезпечена на рівні 5 %. CCb розраховується таким чином:

1) метод 1: за процедурою калібрувальної кривої відповідно до норм, визначених ДСТУ ISO 11843-1:2005 "Статистичний контроль. Здатність до виявлення. Частина 1. Терміни та визначення" (визначено як мінімальне виявлюване значення чистої змінної стану). У цьому випадку використовується репрезентативний порожній матеріал, який збагачений на рівні та нижче допустимої межі, починаючи з STC рівномірними кроками. Проведіть дослідження (випробування) зразків та ідентифікуйте аналіт(и). Обчисліть стандартне відхилення середнього виміряного вмісту при STC. Відповідна концентрація при STC плюс 1,64-кратне стандартне відхилення внутрішньолабораторної відтворюваності середнього виміряного вмісту при STC дорівнює можливості виявлення;

2) метод 2: шляхом дослідження збагаченого порожнього матеріалу за рівнів концентрації нижче допустимої межі. Для кожного рівня концентрації необхідно провести дослідження (випробування) 20 збагачених порожніх зразків, щоб забезпечити надійну основу для цього визначення. Рівень концентрації, за якого залишається лише

≤ 5 % хибно відповідних результатів, дорівнює можливості виявлення;

Для дозволених речовин, залежно від валідаційного експерименту (та його відповідних ступенів свободи), може бути доцільно застосувати t-розподіл, або - якщо за основу взято нормальний (гаусівський) розподіл (односторонній, n =

∞) - слід використовувати k-фактор 1,64 (незалежно від того, чи це каскадне використання, чи звичайне використання MRL).

7. Валідація: калібрувальні криві, абсолютне відновлення та відносні матричні ефекти

1. При використанні калібрувальних кривих для кількісного визначення використовується такий підхід:

1) при побудові кривої слід використовувати щонайменше п'ять бажано рівновіддалених рівнів (включаючи нульовий рівень);

2) повинен бути описаний робочий діапазон кривої;

3) повинні бути описані математична формула кривої та ступінь відповідності даних (коефіцієнт детермінації R2) кривій;

4) повинні бути описані діапазони прийнятності для параметрів кривої.

2. Для калібрувальних кривих, що базуються на стандартному розчині, для матрично-відповідних стандартів або матрично-збагачених стандартів мають бути вказані прийнятні діапазони для параметрів калібрувальної кривої, які можуть змінюватися від серії до серії.

3. Абсолютне відновлення методу не потрібно визначати, якщо доступний внутрішній стандарт, матрично-збагачене калібрування, або обидва згадані методи. В усіх інших випадках абсолютне відновлення методу має бути визначене.

4. Якщо вимоги до правильності, зазначені в додатку 1 до цих Методів, виконані, можна використовувати фіксований коефіцієнт корекції. В іншому випадку слід використовувати коефіцієнт відновлення, отриманий для цієї конкретної партії. Як альтернатива, замість використання коефіцієнта корекції на відновлення слід використовувати процедуру

стандартного додавання або внутрішній стандарт. Кількість доданого стандартного аналіту може бути, наприклад, від двох до п'яти разів більшою за розрахункову кількість аналіту у зразку. Ця процедура призначена для визначення вмісту аналіту у зразку з урахуванням відновлення аналітичної процедури.

5. Абсолютне відновлення розраховується щонайменше для шести репрезентативних партій матриці.

6. Аліквоту порожньої матриці необхідно збагатити аналітом перед екстракцією, а другу аліквоту порожньої матриці необхідно збагатити після підготовки зразка до відповідного рівня концентрації та визначити концентрацію аналіту.

7. Відновлення (Rec) розраховується так:

Rec (аналіт) = (площа матрично-збагаченого стандарту) / (площа матрично-відповідного стандарту) х 100.

8. Відносний матричний ефект слід визначати у всіх випадках. Це можна зробити або в рамках валідації, або в окремих експериментах. Розрахунок відносного матричного ефекту слід проводити щонайменше для 20 різних порожніх партій (матриця / вид), відповідно до сфери застосування методу, наприклад, для різних видів, які необхідно охопити.

9. Порожню матрицю після екстракції слід збагатити аналітом на рівні RPA, MRL або ML та провести дослідження (випробування) разом із чистим розчином аналіту.

10. Відносний матричний ефект або матричний фактор (MF) розраховується як:

MF (стандарт) =

площа піку MMS стандарту

____________________________________________

площа піку стандартного розчину

MF (IS) =

площа піку матрично-відповідного IS

__________________________________________

площа піку розчину IS

MF (стандарт нормалізований для IS) =

MF (стандарт)

____________________

MF (IS)

, де:

IS - внутрішній стандарт,

MMS - матрично-відповідний стандарт.

11. Коефіцієнт варіації не повинен перевищувати значення, наведені в додатку 2 до цих Методів для MF (стандарт, нормалізований для IS).

8. Контроль якості під час рутинного дослідження (випробування), постійна перевірка ефективності методу

1. Потрібно дотримуватися вимог щодо забезпечення якості результатів досліджень (випробувань), викладених у ДСТУ EN ISO/IEC 17025:2019 (EN ISO/IEC 17025:2017, IDT; ISO/IEC 17025:2017, IDT) "Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій".

2. Під час рутинного дослідження (випробування) кращим варіантом для підтвердження ефективності методу є дослідження (випробування) сертифікованих еталонних матеріалів (CRM). Оскільки CRM, що містять відповідні аналіти в необхідних рівнях концентрації, рідко доступні, як альтернатива також можуть бути використані еталонні матеріали, надані та охарактеризовані європейськими референтними лабораторіями (EURLs) або лабораторіями, які акредитовані відповідно до вимог ДСТУ EN ISO/IEC 17043:2017 (EN ISO/IEC 17043:2010; ISO/IEC 17043:2010, IDT) "Оцінка відповідності. Загальні вимоги до перевірки професійного рівня".

Як ще одна альтернатива можуть бути використані внутрішні еталонні матеріали, які регулярно контролюються.

3. Для етапу скринінгового дослідження для кожної серії (партії) проведених досліджень (випробувань) необхідно одночасно провести дослідження (випробування) набору таких зразків для контролю якості:

контрольний зразок для перевірки придатності приладу до роботи в системі, бажано специфічний для даного методу;

зразки для контролю якості, збагачені до концентрації, близької до STC, а найкраще до CCb, для скринінгу на дозволені фармакологічні діючі речовини, а також на заборонені або недозволені речовини;

відповідний контрольний зразок (порожні зразки) та, за потреби, реагенти для порожніх зразків.

4. Для підтверджувального етапу для кожної серії (партії) проведених досліджень (випробувань) необхідно одночасно провести дослідження (випробування) набору таких зразків для контролю якості:

зразки для контролю якості, збагачені до концентрації, близької до MRL або ML для дозволених фармакологічних діючих речовин, або близької до RPA або LCL для

заборонених або недозволених речовин (невідповідні контрольні зразки);

відповідний контрольний зразок (порожні зразки) та, за потреби, реагенти для порожніх зразків.

5. Для зразків для контролю якості застосовується такий порядок: контрольний зразок для перевірки придатності приладу до роботи в системі, відповідний контрольний зразок, зразок/зразки для підтвердження, знову відповідний контрольний зразок, а також збагачений зразок для контролю якості (невідповідні контрольні зразки).

6. Для кількісних методів щодо кожної партії зразків для цілей державного контролю калібрувальна крива повинна бути проаналізована та виміряна до або після зразків, зазначених у пунктах 3 - 5 цього підрозділу.

7. За можливості, правильність (на основі збагачених зразків) усіх цільових аналітів у невідповідних контрольних зразках має бути оцінена за допомогою карт контролю якості відповідно до ДСТУ EN ISO/IEC 17025:2019 (EN ISO/IEC 17025:2017, IDT; ISO/IEC 17025:2017, IDT) "Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій". Якщо це вимагає непропорційно великої кількості визначень правильності, кількість аналітів може бути зменшена до кількості репрезентативних аналітів.

9. Розширення валідованої сфери раніше валідованого методу

1. При виникненні необхідності розширення сфери застосування методу, який уже пройшов повну валідацію, це розширення сфери застосування слід здійснювати ефективним та аналітично обґрунтованим способом. Цього можна досягти шляхом проведення валідації на зменшеній кількості зразків (наприклад, половині кількості зразків) порівняно з повною валідацією.

Однак тип та кількість модифікацій, що підлягають валідації в рамках однієї скороченої схеми валідації, завжди повинні базуватися на експертних знаннях та попередньому досвіді, наприклад, зміна техніки виявлення у будь-якому випадку вимагатиме проведення повної валідації.

Загалом, для забезпечення постійної валідності методу його ефективність слід постійно контролювати та порівнювати з початково отриманими параметрами валідації. В ідеалі цей постійний контроль ефективності методу має бути розроблений таким чином, щоб відсутні дані для повної валідації могли бути зібрані з часом (наприклад, за допомогою декількох точок даних зі зразків для контролю якості в кожній серії досліджень (випробувань)).

2. У разі змін максимальних меж залишків (MRL), максимальних рівнів (ML) та контрольних значень для вжиття заходів (RPA) може виникнути необхідність коригування діапазону концентрацій, для якого метод був валідований. У такому випадку допускається застосування скороченої схеми валідації.

Калібрувальні криві для зміненого діапазону готуються відповідно до валідованої процедури. Слід дослідити різні партії, збагачені різними рівнями концентрації, відповідно до пунктів 2 - 14 підрозділу 3 цього розділу. Значення правильності, повторюваності та внутрішньолабораторної відтворюваності / проміжної прецизійності повинні бути в межах прийнятного діапазону порівняно з відповідними показниками початково валідованого методу. За потреби слід виконати перерахунок CCb (методи скринінгу) та CCa (підтверджувальні методи).

3. Розширення методу на додаткові сполуки можливе лише для аналітів, які за своєю структурою та характеристиками подібні до тих, що вже включені до методу дослідження (випробування). У такому випадку допускається застосування скороченої схеми валідації. Так само не допускаються жодні відхилення від опису методу.

Калібрувальні криві для додаткових речовин слід готувати відповідно до валідованої процедури. Слід дослідити різні партії матричних матеріалів, збагачених різними рівнями концентрації, відповідно до пунктів 2 - 14 підрозділу 3 цього розділу. Значення правильності, повторюваності та внутрішньолабораторної відтворюваності / проміжної прецизійності повинні бути в межах діапазону, порівнюваного з іншими аналітами початково валідованого методу та відповідати вимогам, встановленим у пункті 3 підрозділу 2 цього розділу. Необхідно провести розрахунок CCb (методи скринінгу) та CCa (підтверджувальні методи) для нових аналітів.

4. Рішення

про включення нових матриць або видів до вже валідованого методу дослідження (випробування) завжди має прийматися в кожному окремому випадку на основі знань та досвіду, отриманих до цього часу під час застосування цього методу, а також попередніх експериментів з оцінки потенційних ефектів матриці та інтерференцій. Як правило, це буде можливо лише для матриць, які демонструють подібні властивості, та для некритичних аналітів (стабільність, виявлюваність).

Калібрувальні криві (стандартні або матричні) слід готувати відповідно до валідованої процедури. Слід дослідити різні партії матричного матеріалу, збагаченого різними рівнями концентрації, відповідно до пунктів 2 - 14 підрозділу 3 цього розділу. Значення правильності, повторюваності та внутрішньолабораторної відтворюваності / проміжної прецизійності повинні бути в межах прийнятного діапазону порівняно з показниками початково валідованого методу та відповідати вимогам, встановленим у пункті 3 підрозділу 2 цього розділу. Залежно від підходу до валідації може знадобитися перерахунок CCb (методи скринінгу) або CCa (підтверджувальні методи).

Якщо результати не знаходяться в межах прийнятного діапазону порівняно зі значеннями для вихідної матриці, необхідна додаткова повна валідація, щоб визначити специфічні параметри ефективності для матриці/виду.

У випадках, коли MRL для конкретної речовини відрізняються для певних матриць, найімовірніше буде складно адаптувати сферу застосування методу до додаткової матриці/виду та концентрації, оскільки в цьому випадку необхідно враховувати дві модифікації. У таких випадках необхідне проведення повної валідації.

Міністр аграрної політики

та продовольства України

Тарас ВИСОЦЬКИЙ

Додаток 1

до Методів відбору зразків та лабораторних досліджень (випробувань) для визначення залишків фармакологічних діючих речовин, які застосовуються тваринам, призначеним для виробництва харчових продуктів, для цілей державного контролю

(пункт 2 підрозділу 1 розділу III)

Діапазони

мінімальної правильності кількісних методів

Масова частка

Діапазон

≤ 1 мкг/кг

від -50 % до +20 %

> 1 мкг/кг до 10 мкг/кг

від -30 % до +20 %

≥ 10 мкг/кг

від -20 % до +20 %

____________

Додаток 2

(пункт 2 підрозділу 1 розділу III)

Прийнятний коефіцієнт варіації

Масова частка

Відтворюваність CV (%)

> 1000 мкг/кг

|(адаптовано з рівняння Горвіца)

> 120 мкг/кг - 1000 мкг/кг

(адаптовано з рівняння Горвіца)

10 - 120 мкг/кг

251

< 10 мкг/кг

301

____________

1 Наведений коефіцієнт варіації (CV) (%) є орієнтовним і має бути якомога нижчим.

____________

Додаток 3

(пункт 4 підрозділу 1 розділу III)

Класифікація методів досліджень (випробувань) за характеристиками ефективності, які необхідно визначити

Метод

Підтвердження

Скринінг

Якісний

Кількісний

Якісний

Напівкількісний1

Кількісний

Речовини

А, Б

Ідентифікація відповідно до пунктів 2 - 6 підрозділу 2 розділу III цих Методів

CCa

CCb

Правильність

Прецизійність

(х)

Відносний матричний ефект / абсолютне відновлення2

Селективність / Специфічність

Стабільність3

Стійкість

х - потрібно довести за допомогою валідації, що вимоги до характеристики ефективності виконані;

(х) - вимоги прецизійності, викладені у підпунктах 3, 4 пункту 3 підрозділу 2 розділу III цих Методів, не обов'язково повинні виконуватися для напівкількісних методів скринінгу. Однак, прецизійність має бути визначена для того, щоб довести придатність методу для уникнення хибно відповідних

результатів досліджень (випробувань);

А - заборонені або недозволені речовини;

Б - дозволені речовини.

____________

1 Напівкількісний метод скринінгу – це метод скринінгу, який дає кількісні результати, але не відповідає вимогам прецизійності, наведеним у додатку 2 до цих Методів.

2 Релевантно для методів мас-спектрометрії, щоб довести за допомогою валідації, що вимоги до характеристик ефективності виконані. Відносний матричний ефект методу визначається, якщо цей ефект не оцінювався під час процедури валідації. Абсолютне відновлення методу визначається, якщо не використовується внутрішній стандарт або матрично-збагачене калібрування.

3 Якщо дані щодо стабільності аналітів у матриці доступні з наукової літератури або з іншої лабораторії, ці дані не потрібно визначати повторно у відповідній лабораторії. Однак посилання на доступні дані про стабільність аналітів у розчині прийнятне лише за умови застосування ідентичних умов.

____________

Додаток 4

(підпункт 9 пункту 5 підрозділу 2 розділу III)